Картирование генома и обратная генетика. Буторина А.К - 9 стр.

                                   9
тидов) сегменты одноцепочечной ДНК (или РНК), комплементарные ис-
комому гену. Эти короткие олигонуклеотиды соединяются только с тем
участком ДНК, который содержит последовательность нуклеотидов, стро-
го соответствующую (комплементарную) последовательности нуклеотидов
зонда. Следовательно, наличие связавшейся с ДНК метки с высокой точ-
ностью свидетельствует о присутствии в анализируемом образце искомых
последовательностей нуклеотидов.
      Локусы генов, комплементарные зондам, могут быть картированы
непосредственно на хромосоме путем регистрации радиоактивной метки
(при ISH-гибридизации) или рисунку окрашенных флуоресцентным краси-
телем полос (при FISH-гибридизации). Таким образом, гибридизация in situ
– это метод выявления (картирования) определенных участков молекулы
ДНК на препаратах хромосом, где после денатурации ДНК (путем нагре-
вания или обработки щелочью) осуществляется ее отжиг с одноцепочеч-
ными комплементарными зондами. Отжиг – это процесс восстановления
(ренатурации) двухцепочечной молекулы ДНК из однонитчатых полинук-
леотидных цепей путем постепенного охлаждения. Образование гибрид-
ных дуплексов происходит только при условии комплементарности осно-
ваний исследуемой молекулы ДНК и молекулы зонда, что можно устано-
вить с помощью метода авторадиографии (в случае ISH-гибридизации) или
применения флуоресцентного микроскопа (при FISH-гибридизации).
      Вышеназванные методы используются не только для картирования
хромосом человека, но и многих животных, а также растений (например,
пшеницы).
      Какова разрешающая способность данного метода? При рутинной
(обычной) окраске хромосом самый маленький нарушенный участок хро-
мосомы в виде делеций или дупликаций, который можно различить под
световым микроскопом, содержит 30⋅106 нуклеотидов. Применение мето-
дов дифференциальной окраски хромосом увеличивает такую возможность
до (7…10)⋅106 нуклеотидов. Для всех хромосом человека построены мел-
комасштабные генетические карты с расстоянием между соседними мар-
керами 7-10 млн. пар нуклеотидов или 7-10 Мб (мегабаз; 1 Мб=1 млн пн).
Современные методы гибридизации in situ с использованием метафазных
хромосом, главным образом, метод FISH, локализуют генетические марке-
ры в пределах 2–5 млн пн. Более того, при гибридизации in situ с интер-
фазными хромосомами, в которых генетический материал находится в ме-
нее компактной форме, разрешающая способность хромосомных карт при-
ближается к 100 тпн. Современные сведения о генетических картах чело-
века содержат информацию о более чем 50000 маркеров.

     1.1.2. Хромосомный пейнтинг
     В цитогенетике конца 90-х годов 20 века появились новые мощные
методы, в основе которых лежит флуоресцентная гибридизация нуклеино-
вых кислот in situ (FISH-гибридизация). Это связано с применением новых,
более эффективных флуорохромов и нового оборудования для анализа