Идентификация и исследование экспрессии генов. Епринцев А.Т - 23 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

ВГУ | Воронеж

Составители: 

Рубрика: 

23
2. Перемешать и инкубировать при 70
о
С 5 минут и быстро пере-
нести на лед.
3.
Добавить следующие компоненты:
a.
10х реакционный буфер – 2 мкл,
b.
10мМ дНТФ – 2 мкл,
c.
ингибитор рибонуклеаз – 20 ед.,
d.
деионизованной воды до 19 мкл.
4.
Инкубировать смесь при 37
о
С 5 минут. Если использовались
random hexamer, то инкубировать при 25
о
С 5 минут.
5.
Добавить 200 ед. M-MuLV Reverse Transcriptase, инкубировать
реакционную смесь, содержащую oligo(dT) и специфический
праймер при 37–42
о
С 60 минут. Если использовались random
hexamer, инкубацию проводить при 25
о
С 60 минут.
6.
Остановить реакцию нагреванием до 70
о
С. Охладить на льду.
Комментарии к методике:
1) Синтезированная кДНК может использоваться непосредственно для амплификации
методом ПЦР. Однако можно провести очистку полученной кДНК методом фенол-
хлороформной экстракции и осаждением этанолом, что позволит избавиться от
примесей, влияющих на качество ПЦР.
Глава II. Полимеразная цепная реакция
Суть полимеразной цепной реакции (ПЦР) заключается в амплифи-
кации (умножении) в пробирке определенного участка ДНК в процессе по-
вторяющихся температурных циклов. В основе ПЦР лежит обычная био-
химическая реакция синтеза, катализируемая ферментом ДНК-
полимеразой. 
         2. Перемешать и инкубировать при 70 оС 5 минут и быстро пере-
             нести на лед.
         3. Добавить следующие компоненты:
                 a. 10х реакционный буфер – 2 мкл,
                 b. 10мМ дНТФ – 2 мкл,
                 c. ингибитор рибонуклеаз – 20 ед.,
                 d. деионизованной воды до 19 мкл.
         4. Инкубировать смесь при 37 оС 5 минут. Если использовались
             random hexamer, то инкубировать при 25 оС 5 минут.
         5. Добавить 200 ед. M-MuLV Reverse Transcriptase, инкубировать
             реакционную смесь, содержащую oligo(dT) и специфический
             праймер при 37–42 оС 60 минут. Если использовались random
             hexamer, инкубацию проводить при 25 оС 60 минут.
         6. Остановить реакцию нагреванием до 70 оС. Охладить на льду.

Комментарии к методике:
1) Синтезированная кДНК может использоваться непосредственно для амплификации
   методом ПЦР. Однако можно провести очистку полученной кДНК методом фенол-
   хлороформной экстракции и осаждением этанолом, что позволит избавиться от
   примесей, влияющих на качество ПЦР.




                Глава II. Полимеразная цепная реакция


      Суть полимеразной цепной реакции (ПЦР) заключается в амплифи-
кации (умножении) в пробирке определенного участка ДНК в процессе по-
вторяющихся температурных циклов. В основе ПЦР лежит обычная био-
химическая     реакция       синтеза,    катализируемая   ферментом    ДНК-
полимеразой.


                                         23

Страницы