Идентификация и исследование экспрессии генов. Епринцев А.Т - 29 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

ВГУ | Воронеж

Составители: 

Рубрика: 

29
кому уменьшению вероятности контаминации исследуемых проб продук-
тами амплификации. Кроме того флуоресцентная детекция продуктов ПЦР
в пробирке в 2–3 раза чувствительнее электрофорезной детекции.
Ниже представлены наиболее распространенные методы детекции
продуктов амплификации ДНК-олигонуклеотидных последовательностей.
Данные методы можно разделить на 2 основные группы.
В первой группе методов, детектирующих ДНК, находятся методы,
использующие олигонуклеотиды или
зонды, меченые красителем, обла-
дающим способностью к флуоресценции.
1. Метод гидролизуемых проб или
Taqman. В данном случае в реак-
ционную смесь добавляют ДНК-зонды, в состав которых входит
флуоресцентная метка в 5’-положении и гаситель флуоресценции в
3’-положении, а также фосфатная группа в 3’-положении. Эти зонды
имеют места посадки внутри амплифицируемой области. Гаситель по-
глощает испускаемое флуоресцентной меткой излучение, а фосфатная
группа в 3’-положении блокирует
ДНК-полимеразу. В ходе ПЦР во
время стадии отжига праймеров происходит присоединение ДНК-зонда
к комплементарной цепи ДНК, причем, чем больше продуктов ампли-
фикации образуется в ходе ПЦР, тем больше молекул зондов свяжется с
соответствующими ампликонами. Во время стадии элонгации полиме-
раза синтезирует комплементарную цепь ДНК и при достижении зонда
начинает его расщеплять благодаря наличию 5’-экзонуклеазной актив-
ности. Таким образом, происходит разъединение флуоресцентной метки
и гасителя, что приводит к увеличению детектируемого свечения. Чем
больше ампликонов синтезировано в ходе ПЦР на данный момент вре-
мени, тем интенсивнее будет свечение. 
кому уменьшению вероятности контаминации исследуемых проб продук-
тами амплификации. Кроме того флуоресцентная детекция продуктов ПЦР
в пробирке в 2–3 раза чувствительнее электрофорезной детекции.
     Ниже представлены наиболее распространенные методы детекции
продуктов амплификации ДНК-олигонуклеотидных последовательностей.
Данные методы можно разделить на 2 основные группы.
     В первой группе методов, детектирующих ДНК, находятся методы,
использующие олигонуклеотиды или зонды, меченые красителем, обла-
дающим способностью к флуоресценции.


  1. Метод гидролизуемых проб или Taqman. В данном случае в реак-
  ционную смесь добавляют ДНК-зонды, в состав которых входит
  флуоресцентная метка в 5’-положении и гаситель флуоресценции в
  3’-положении, а также фосфатная группа в 3’-положении. Эти зонды
  имеют места посадки внутри амплифицируемой области. Гаситель по-
  глощает испускаемое флуоресцентной меткой излучение, а фосфатная
  группа в 3’-положении блокирует ДНК-полимеразу. В ходе ПЦР во
  время стадии отжига праймеров происходит присоединение ДНК-зонда
  к комплементарной цепи ДНК, причем, чем больше продуктов ампли-
  фикации образуется в ходе ПЦР, тем больше молекул зондов свяжется с
  соответствующими ампликонами. Во время стадии элонгации полиме-
  раза синтезирует комплементарную цепь ДНК и при достижении зонда
  начинает его расщеплять благодаря наличию 5’-экзонуклеазной актив-
  ности. Таким образом, происходит разъединение флуоресцентной метки
  и гасителя, что приводит к увеличению детектируемого свечения. Чем
  больше ампликонов синтезировано в ходе ПЦР на данный момент вре-
  мени, тем интенсивнее будет свечение.




                                  29

Страницы