Идентификация и исследование экспрессии генов. Епринцев А.Т - 27 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

ВГУ | Воронеж

Составители: 

Рубрика: 

27
Компонент Конечная концентра-
ция
Количество компонента
на 50 мкл смеси
10х ПЦР-буфер 1х 5 мкл
10мМ смесь дНТФ 0.2 мМ каждого 1 мкл
Праймер 1 (50 мкМ) 1 мкМ 1мкл
Праймер 2 (50 мкМ) 1 мкМ 1мкл
Taq-ДНК-полимераза 1.25 ед. 0.5 мкл
25мМ MgCI
2
1–4 мМ 2–5 мкл
ДНК-матрица 0.1–1 мкг варьирует от концен-
трации образца
Деионизованная вода – до 50 мкл
3.
Перемешать на вортексе. При необходимости добавить минераль-
ное масло (20–40 мкл) для ПЦР.
4.
Поместить образцы в ДНК-амплификатор и запустить программу.
Комментарии к методике:
1) Если матрица одноцепочечная или ПЦР-продукт, этап начальной денатурации мож-
но опустить. Кольцевая плазмидная или геномная ДНК требует тепловой денатура-
ции при 95
o
C не менее 3 минут. Однако в данном случае не следует злоупотреблять
нагреванием, поскольку часть матрицы может повредиться. Для каждого типа ДНК-
матрицы необходимо подбирать индивидуальное компромиссное решение.
2) Число циклов обычно 25–35. Слишком большое число циклов чревато насыщением
PCR реакции: ограничение по праймерам (синтез длинных продуктов, образован-
ных в результате использования в качестве
праймера готового продукта), ограниче-
ние по нуклеотидам (большая доля одноцепочечных продуктов, синтез коротких
продуктов).
3) Для повышения специфичности ПЦР можно использовать технику так называемого
горячего старта, суть которого заключается в добавлении фермента в пробирку с
реакционной смесью только после проведения первой денатурации.
4) Для проведения ПЦР часто бывает удобно использовать
смеси:
a) все, кроме матрицы и Taq-полимеразы. Хранить при –20
o
С продолжительное
время, при 4
o
С – несколько суток;
b) все, кроме матрицы и праймеров. Хранить при –70
o
С и –20
o
С продолжитель-
ное время, при 4
o
С – несколько недель. 
       Компонент            Конечная концентра-        Количество компонента
                            ция                        на 50 мкл смеси
10х ПЦР-буфер               1х                         5 мкл
10мМ смесь дНТФ             0.2 мМ каждого             1 мкл
Праймер 1 (50 мкМ)          1 мкМ                      1мкл
Праймер 2 (50 мкМ)          1 мкМ                      1мкл
Taq-ДНК-полимераза          1.25 ед.                   0.5 мкл
25мМ MgCI2                  1–4 мМ                     2–5 мкл
ДНК-матрица                 0.1–1 мкг                  варьирует от концен-
                                                       трации образца
Деионизованная вода         –                          до 50 мкл

      3. Перемешать на вортексе. При необходимости добавить минераль-
         ное масло (20–40 мкл) для ПЦР.
      4. Поместить образцы в ДНК-амплификатор и запустить программу.


Комментарии к методике:
1) Если матрица одноцепочечная или ПЦР-продукт, этап начальной денатурации мож-
   но опустить. Кольцевая плазмидная или геномная ДНК требует тепловой денатура-
   ции при 95 oC не менее 3 минут. Однако в данном случае не следует злоупотреблять
   нагреванием, поскольку часть матрицы может повредиться. Для каждого типа ДНК-
   матрицы необходимо подбирать индивидуальное компромиссное решение.
2) Число циклов обычно 25–35. Слишком большое число циклов чревато насыщением
   PCR реакции: ограничение по праймерам (синтез длинных продуктов, образован-
   ных в результате использования в качестве праймера готового продукта), ограниче-
   ние по нуклеотидам (большая доля одноцепочечных продуктов, синтез коротких
   продуктов).
3) Для повышения специфичности ПЦР можно использовать технику так называемого
   горячего старта, суть которого заключается в добавлении фермента в пробирку с
   реакционной смесью только после проведения первой денатурации.
4) Для проведения ПЦР часто бывает удобно использовать смеси:
    a) все, кроме матрицы и Taq-полимеразы. Хранить при –20 oС продолжительное
    время, при 4 oС – несколько суток;
    b) все, кроме матрицы и праймеров. Хранить при –70 oС и –20 oС продолжитель-
    ное время, при 4 oС – несколько недель.
                                         27

Страницы