Биотехнология. Коростелева Н.И - 32 стр.

    Однако рестриктазы не «выстригают» полностью ген и его
нужно либо достраивать химическим путем, либо отщеплять
лишние нуклеотидные последовательности.
    3. Ферментативный синтез генов стал возможен после от-
крытия фермента обратной транскриптазы или ДНК-ревертазы
(Г. Тёмин, Мизутани, 1970), выделенной из онкогенных виру-
сов. Ревертазы могут синтезировать комплементарную цепь
ДНК (к-ДНК) на РНК-матрице.
    При помощи ДНК-зонда (одноцепочечная меченая молекула
ДНК, комплементарная какому-либо участку и-РНК) находят
информационную (матричную) РНК. Практически все эукарио-
тические и-РНК содержат на своем 3' конце последовательность,
состоящую из остатков аденина (поли А-последовательность),
которая присоединяется к и-РНК в результате сплайсинга.
    Для начала реакции синтеза ДНК-ревертазе нужна затравка
в виде небольшого двухцепочечного отрезка. Эту функцию вы-
полняют короткие олигонуклеотиды из 18-20 тиминовых остат-
ков (поли д-Т), которые соединяются по принципу комплемен-
тарности с поли А-последовательностью и-РНК. В результате
образуется гибридная и-РНК – к-ДНК молекула, причем на кон-
це у нее будет синтезироваться короткий отрезок двухцепочеч-
ной ДНК – шпилька. Шпилька служит затравкой для синтеза
второй комплементарной цепи ДНК, осуществляющегося уже
ферментом ДНК-полимеразой (рис. 6).
    Цепь и-РНК гидролизуется РНК-азой, а шпилька (одноцепо-
чечная ДНК) – эндонуклеазой S1. В результате получится двух-
цепочечная молекула к-ДНК, соответствуюшая структурному
гену, с которого транскрибировалась исходная молекула и-РНК.
    К полученной ДНК присоединяют «липкие» концы для
встраивания в плазмиду и размножения гена. Подобная схема
была использована для получения генов, кодирующих инсулин,
гормона роста, интерферона, альбумина, иммуноглобулинов и
др. белков, производство которых уже налажено в промышлен-
ных масштабах.
    Возможно и соединение фрагментов ДНК с «тупыми» кон-
цами за счет действия ДНК-лигазы, но эффективность такого
«сшивания» на порядок ниже.


                             32