Биотехнология. Часть 1. Физико-химические свойства ферментов. Ковалева Т.А. - 18 стр.

определяющие взаимодействие крахмалсвязывающего домена с каталитическим и
соответствующую ориентацию молекулы субстрата. Гликозилирование предотвращает
скопление молекул субстрата в связывающих центрах и обеспечивает стехиометрическое
связывание.
      В связывании молекул субстрата участвует прежде всего Тrр-120, входящий в
состав первого подцентра. При модификации этого аминокислотного остатка с помощью
генно-инженерных подходов молекула фермента утрачивала каталитическую активность.
Взаимодействие с Тrр-120, участвующем в формировании щели активного центра,
приводит к втягиванию молекулы субстрата в щель активного центра и сопровождается
искривлением гликозидной связи. Роль функциональных каталитических групп играют
Glu-179, Glu-400 и Asp-55. Щель активного центра имеет нескомпенсированный
отрицательный заряд, эти группы занимают определенное положение и сольватированы.
Молекула субстрата, внедряясь в полость активного центра, перемещает кластер молекул
воды из активного центра в менее полярную среду, что благоприятствует ионизации Glu-
179. Выведение молекул воды, располагающихся в активном центре, освобождает полость
активного центра для молекул субстрата. Результаты наших экспериментов также
показывают, что такие ингибиторы, как нитрат, салицилат и перхлорат дигидрохинолина
эффективны потому, что, в отличие от субстрата, уменьшают отрицательный заряд
активного центра.
      Методом рентгенострукгурного анализа определено, что 7 молекул воды связаны с
подцентром 1 и 6 из них перемещаются вместе с молекулой субстрата, покидая активный
центр через узкий канал. Тrр-120 играет ключевую роль в стабилизации центров
связывания. При фотоокислении глюкоамилазы в присутствии метиленового синего,
кроме гистидина подвергается воздействию индольное кольцо триптофана и тирозина.
Эти воздействия не приводят к потере каталитической активности нативного фермента.
По-видимому, О-гликозилированные участки крахмалсвязывающего домена прежде всего
взаимодействуют с молекулой субстрата. При дегликозилировании глюкоамилазы и
модификации Тrр-120 каталитическая активность исчезает полностью. При исследовании
структуры комплекса акарбозы с глюкоамилазой, включающей 1 – 471 аминокислотные
остатки   и   535   центров   связывания   молекул   воды,   установлено,   что   Тrр-120
взаимодействует с подцентрами 1 и 2 и с Glu-179 при помощи водородных связей. Причем
связывание глюкозного остатка с подцентром 1 не сопровождается изменением ∆G, а
взаимодействие с подцентром 2 приводит к отрицательному значению ∆G, что и
обусловливает независимое связывание глюкозных единиц субстрата с каждым из
подцентров активного центра. Комплексообразование субстрата с "аффинным" сайтом