Методы определения редокс-статуса культивируемых клеток растений. Сибгатуллина Г.В - 16 стр.

ступке в 300-400 мкл экстракционного буфера. Гомогенат центрифугировать в
течение 5 мин при 12 000g. Пробы хранить в холодильнике при 4 °С.
     Реакционная смесь содержит:
     0,5 мл 0,05% раствора NBT
     0,9 мл 50 мМ K,Na-фосфатного буфера (рН 7,8)
     100 мкл экстракта
     20 мкл 0,24% раствора Na-ЭДТА
     Для каждого образца сделать 2 одинаковые пробирки с реакционной
смесью и экстрактом. Одну пробирку поместить в темноту (шкаф) – темновой
контроль, другую выставить на свет. Реакционные смеси для света и темноты
по своему составу ничем не отличаются!
     Кроме того, необходимо приготовить контрольные пробирки без
ферментативной вытяжки – для расчета максимального образования
формазана. В эти пробирки вместо экстракта следует внести 100 мкл K,Na-
фосфатного буфера.
     Реакция запускается добавлением 20 мкл 0,025% рибофлавина во все
пробирки. Содержимое пробирок быстро перемешать. Темновые контроли,
включая пробирки для определения максимального образования формазана,
поместить в тёмное место. Остальные пробирки установить под двумя
люминесцентными лампами (по 18 Вт).
     Реакция идёт 15 мин. По истечении времени реакцию следует остановить
выключением света. До определения оптической плотности пробы следует
держать в темноте. Оптическую плотность измеряют при длине волны 560 нм.
                                 Расчёты
     За   единицу   активности   СОД     принимают   количество     фермента,
способного подавить реакцию восстановления нитросинего тетразолия на 50%.
Сначала вычисляется соответствие полученной оптической плотности единице
активности. Для этого полученная оптическая плотность максимального
образования формазана делится на два и принимается за 50% ингибирования
или 0,5 единиц. Расчет производится по формуле:

                                       16