Методы определения редокс-статуса культивируемых клеток растений. Сибгатуллина Г.В - 18 стр.

               1.5. Определение активности глутатионредуктазы
     Активность фермента определяют согласно методу, описанному Верлан
(Верлан, 2008). Глутатионредуктаза катализирует восстановление окисленного
глутатиона, используя в качестве восстановительного эквивалента НАДФН.
Метод основан на изменении абсорбции раствора при образовании окисленной
формы НАДФ+.
                           Необходимые реактивы:
1) экстракционный буфер (680 мг К2НРО4, 4 г ПВП, 3 мг Na-ЭДТА, 280 мкл
Tритон X-100 растворить в дистиллированной воде и довести до 100 мл).
Непосредственно перед использованием на каждые 20 мл буфера добавить
4,6 мг   аскорбиновой      кислоты     и        200 мкл      100   мМ       раствора
фенилметилсульфонилфторида (ФМСФ) (34 мг ФМСФ растворить в 2 мл
изопропилового спирта) (расчёт на 26 проб).
2) буфер измерения, рН 8,0 (6.05 г Tрис·HCl (трис(гидроксиметил)аминометан)
и 146 мг Na-ЭДТА растворить и довести до объёма 500 мл. Скорректировать
значение рН с помощью концентрированной HCl).
3) 0,4% раствор НАДФН (4 мг НАДФН растворить в 1 мл деионизированной
воды mQ).
4) 3% раствор окисленного глутатиона (15,3 мг окисленного глутатиона
растворить в 0,5 мл mQ).
                                  Ход работы
     К   250     мг   навески   добавить   0,75 мл        экстракционного    буфера,
содержащего 1,3 мM аскорбиновой кислоты. Растереть в жидком азоте и затем
центрифугировать 10 мин при 12 000 g. Пробы до измерения хранить при 4 °С.
     Экспериментальная кювета содержит:
     1,91 мл буфера измерения,
     50 мкл экстракта,
     20 мкл 0,4% раствора НАДФН,
     Контрольная кювета содержит:
     1.93 мл буфера измерения,

                                           18