Методы определения редокс-статуса культивируемых клеток растений. Сибгатуллина Г.В - 20 стр.

             1.6. Определение активности глутатионпероксидазы
      Принцип      метода:      глутатионпероксидаза           катализирует    реакцию
взаимодействия восстановленного глутатиона (GSH) с гидроперекисью трет-
бутила (ГПТБ). Активность фермента при этом может быть оценена по
изменению содержания GSH в пробах до и после инкубации с субстратом в
ходе цветной реакции с 5,5’-дитиобис-2-нитробензойной кислотой (ДТНБК)
(Paglia, Valentine, 1967).
                              Необходимые реактивы
1) экстракционный буфер (680 мг К2НРО4, 4 г ПВП, 3 мг Na-ЭДТА, 280 мкл
Tритон X-100 растворить в дистиллированной воде и довести до 100 мл).
Непосредственно         перед      использованием          в      буфер       добавляют
фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ) из расчета 200 мкл 100 мМ раствора
ФМСФ на 20 мл буфера (34 мг ФМСФ растворить в 2 мл изопропилового
спирта).
2) 0,1 М Трис·HCl-буфер, pH 8,5 (1,211 г Tрис·HCl (трис(гидрокси-
метил)аминометан) растворить в 90 мл дистиллированной воды, довести объём
до 100 мл). Довести рН раствора до 8,5 с помощью концентрированной HCl.
3) «сложный» буфер (в 10 мл 0,1 М Трис·HCl-буфера (pH 8,5) растворить 22 мг
Na-ЭДТА и добавить 100 мкл 100 мМ ФМСФ).
4) 4,8 мМ раствор GSH (15 мг GSH растворить в 10 мл «сложного» буфера).
5) 0,14% раствор ГПТБ (2 мкл 80% ГПТБ растворить в 1,14 мл
дистиллированной воды).
6) 20% раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ) (2 г ТХУ растворить в 100 мл
дистиллированной воды).
                                    Ход работы
      Навеску каллусной ткани массой 250 мг растереть холодным пестиком в
холодной ступке в 0,5 мл экстракционного буфера. Далее центрифугировать 10
мин при 12 500 g. Супернатант использовать для анализа.
      0,2   мл    экстракта     смешать   с    0,73   мл       «сложного»     буфера   и
термостатировать 10 мин при 37 °С на водяной бане. По истечении времени

                                              20