Методы определения редокс-статуса культивируемых клеток растений. Сибгатуллина Г.В - 22 стр.

           1.7. Определение активности глутатион-S-трансферазы
     Активность     глутатион-S-трансферазы     определяют        по   скорости
образования глутатион-S-конъюгатов между восстановленным глутатионом
(GSH) и 1-хлор-2,4-динитробензолом (ХДНБ) (Habig et al., 1974).
                            Необходимые реактивы
1) 0,1М K,Na-фосфатный буфер, рН 6,5 (0,68 г KH2PO4 и 0,046 г NaOH
растворить в 50 мл дистиллированной воды и скорректировать рН раствора до
нужного значения с помощью концентрированной H3PO4 или 5% раствором
NaOH).
2) экстракционный буфер (680 мг К2НРО4, 4 г ПВП, 3 мг Na-ЭДТА, 280 мкл
Tритон X-100 растворить в дистиллированной воде и довести до 100 мл).
Непосредственно       перед     использованием       в    буфер        добавить
фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ) из расчёта 200 мкл 100 мМ раствора
ФМСФ на 20 мл буфера (34 мг ФМСФ растворить в 2 мл изопропилового
спирта).
3) 0,015 М раствор GSН (23 мг GSН растворить в 5 мл деионизированной
дистиллированной воды.
4) 0,015 М раствор ХДНБ (15 мг ХДНБ растворить в 5 мл 80% метанола).
                                 Ход работы
     Навеску каллусной ткани массой 350 мг растереть холодным пестиком в
холодной ступке в 0,7 мл экстракционного буфера. Далее центрифугировать 5
мин при 12 000 g. Супернатант использовать для анализа.
     Реакционная смесь содержит:
     2,5 мл 0,1 М калий-фосфатного буфера (рН 6,5)
     0,2 мл 0,015 М раствора GSH
     0,1 мл супернатанта.
     Реакцию инициируют внесением в кювету 0,2 мл 0,015 М ХДНБ.
     Параллельно опытной пробе готовят контрольную пробу, в которую
вносят все выше перечисленные реагенты, кроме ХДНБ.
     Увеличение концентрации конъюгатов в ходе реакции регистрируют

                                        22