ВУЗ:
Составители:
Рубрика:
7. Рекомендуемая влажность питательной среды
Вариант 1 2 3 4 5 6
Заданная влажность, % 45 50 55 60 65 70
Влажность среды до увлажне-
ния, %
Расход воды на 20 г среды, мл
Взвесить навески пшеничных отрубей и древесных опилок по варианту 4 (табл. 5). Рассчитать влажность
среды и расход воды до достижении влажности уменьшая его на 1 мл суспензии посевного материала согласно
заданию. Алгоритм расчета выполнить в журнале работы, результаты внести в табл. 6, 7. Дальнейшие операции
выполнить как в п. 2.
4. Засеять питательную среду суспензией спор гриба.
Для этого в пробирку с культурой гриба на скошенной агаризованной среде заливают стерильную воду до
верхнего края косяка. Конидии переводят концом стерильной пипетки во взвешенное состояние и отбирают 1
мл суспензии спор, перенося ее затем в колбу со стерильной средой. После засева среду тщательно перемеши-
вают путем встряхивания и пересыпают в стерильную кювету, потом закрывают ее крышкой. Кювета имеет
перфорации для воздухообмена. Операции по засеву среды необходимо производить, соблюдая асептические
условия, возле пламени спиртовки.
Кюветы с засеянной средой помещают в термостат. Выращивание длится 48 – 54 ч при температуре 33 °С
в течение первых 12 ч роста, а далее поддерживается на уровне 28 – 30 °С.
Занятие 2
Выросшая культура имеет вид коржа с пушистой поверхностью. Для каждого коржа следует определить влажность (для вы-
сушивания брать 3 г культуры), и амилолитическую активность.
Порядок выполнения работы
1. Провести экстракцию ферментов из выросшей культуры гриба. Корж тщательно измельчают в кювете с помощью шпателя
и на технических весах отвешивают 5 г поверхностной культуры. Шпатель обязательно погрузить в дезинфецирующий раствор.
Взвешенную порцию помещают в фарфоровую ступку и тщательно растирают пестиком со 100 мл забуференной дистиллирован-
ной воды, которую получают смешивая 10 мл ацетатного буфера (рН 4,7) и 90 мл дистиллированной воды. После чего помещают в
термостат на 30 мин при 30 °С. По истечение времени экстракции содержимое фарфоровых ступок переносят на капроновый
фильтр и хорошо отжимают для отделения экстракта от биошрота (остатков питательной среды и мицелия).
2. Определить влажность выросшей культуры, сделать запись в журнале работы аналогично п. 1. занятия 1 данной работы.
3. Осветлить полученный экстракт (вытяжку) путем центрифугирования. Для этого мерным цилиндром
отмеряют 25 мл фильтрата и переносят в центрифужные стаканчики, которые устанавливают на роторе цен-
трифуги попарно напротив друг друга. Центрифугирование длится 5 мин при 3 тыс. оборотах. Осветленный
экстракт сливают в колбу для дальнейшего анализа.
4. Определяют амилолитическую способность (АС) экстракта, используя капельный метод по Климовскому и Родзевич. В
основе метода лежит способность фермента амилазы, находящегося в вытяжке, катализировать гидролиз крахмала до не окраши-
ваемых йодом продуктов.
Для определения АС важно строго соблюдать температурные условия реакции. Для этого все растворы –
субстрат, 1 %-ный раствор крахмала, раствор фермента и дистиллированная вода должны быть нагреты до 30
°С в ультратермостате в течение 10 мин.
В широкую пробирку заливают 25 мл раствора крахмала. Не вынимая пробирок из термостата, с помощью
пипеток добавляют воду, а затем вытяжку от 1 до 25 см
3
. Общий объем реакционной смеси был 50 см
3
. Если
ферментная вытяжка малоактивна, то можно внести только ее в количестве 25 см
3
, а воду вообще не добавлять.
Содержимое в пробирке перемешивают палочкой и отмечают время по секундомеру, когда была добавле-
на вытяжка к раствору крахмала:
• каждые 60 с из пробирки, не вынимая ее из термостата, отбирают палочкой каплю пробы;
• каплю помещают на белую фарфоровую пластину, соединяя эту каплю с каплей рабочего раствора йо-
да и наблюдают окраску;
• реакция расщепления крахмала считается оконченной, когда йод перестает давать изменение окраски
при соединении с каплей испытуемого раствора в течение первых 10 с;
• изменение окраски йода отчетливо видно на границе соприкосновения двух капель – йода и реакцион-
ной смеси.
Время, за которое происходит расщепление крахмала до продуктов, не окрашивающихся йодом, должно
быть в пределах 10 – 20 мин.
Если время гидролиза крахмала менее 10 мин, то определение повторяют, уменьшая объем вытяжки, а
увеличивая объем воды. Если гидролиз крахмала не заканчивается в течение 20 мин, то анализ также повторя-
ют, увеличивая объем ферментной вытяжки и уменьшая объем воды. Количество ферментной вытяжки, кото-
рое необходимо брать на повторный анализ, вычисляют с учетом полученного времени гидролиза. Например,
если ферментная вытяжка имеет малую или слишком высокую активность и количество ферментного раствора
от 1 до 25 см
3
не обеспечивает длительности гидролиза крахмала в течение 10 – 20 мин, для анализа берут не
25 см
3
раствора крахмала, а большее или меньшее его количество, например 10 или 40 см
3
, внося соответст-
вующую поправку в расчетную формулу (соответственно, 0,1 или 0,4 вместо обычных 0,25 г).
Страницы
- « первая
- ‹ предыдущая
- …
- 11
- 12
- 13
- 14
- 15
- …
- следующая ›
- последняя »
