Современные методы исследований в биохимии. Битуева А.В. - 12 стр.

                                                             нанолитров.
         Аналитическая тонкослойная хроматография.
                        Основы метода                                      2.4. Колоночная хроматография
     Тонкослойная хроматография позволяет проводить               Методом колоночной хроматографии (впервые
определение веществ в пределах от 1 до 10 мкг, а на ВЭТСХ-   предложенной М.С. Цветом в 1906 г.) можно разделять смеси
пластинках — в пределах нескольких нанограммов.              веществ как при определении их микроколичеств, так и с
Стартовое пятно должно иметь минимальные размеры, так        препаративной целью. Неподвижную фазу помещают в
как при проявлении пластинки пятна размываются               колонку, затем вносят в нее анализируемую смесь и элюируют
вследствие броуновского движения молекул вещества.           подходящим растворителем. При продвижении по колонке
Если пробу предполагается хроматографировать на              компоненты смеси удерживаются сорбентом в соответствии с
силикагеле или оксиде алюминия (адсорбционная                физико-химическими свойствами и поэтому мигрируют с
хроматография), то образец следует растворять в наименее     разной скоростью. На выходе колонки разделяемые вещества
полярном растворителе (например, гексане). В этом случае     появляются в определенной последовательности и могут быть
вещество сорбируется на носителе сразу после выхода из       собраны в виде отдельных фракций.
капилляра и формирует точечное стартовое пятно. Если              В колоночной хроматографии конечный результат
анализируемый образец растворяется в неполярном рас-         зависит не только от используемого принципа разделения
творителе неполностью, то плохо растворимые компоненты       (адсорбция, распределение, ионообмен или молекулярно-
смеси зарегистрировать не удается и данные о составе смеси   ситовое распределение, гель-хроматография), но и от
будут недостоверны.                                          множества других факторов: условий элюирования (скорость
     Прежде чем начать проявление, необходимо                потока, температура, вязкость элюента); конструкции и раз-
полностью удалить с пластинки растворитель, в котором        меров колонки; нагрузки на колонку (количество пробы);
была растворена проба. Для этого при определении             размера частиц сорбента; конструкции основных элементов
термостабильных веществ используют фен или помещают          хроматографической системы (блок ввода пробы, мертвый
пластинку на короткое время в сушильный шкаф, а при          объем в соединительных шлангах и ячейке детектора);
определении нестабильных веществ пластинку высушивают        качества подготовки пробы к анализу. Качество разделения
в вакуум-эксикаторе. При нанесении пробы рекомендуется:      компонентов (эффективность колонки) зависит также от
—при хроматографии на силикагеле или оксиде алюминия         равномерности упаковки колонки и от скорости установления
растворять образец в наименее полярном растворителе;         равновесия адсорбция—десорбция вещества.
—наносить минимальный объем пробы ( ≈1 мкл);                      Мерой     эффективности     колонки    служит число
—пробу наносить узким капилляром (внутренний                 теоретических тарелок N. Эта величина удобна при
диаметр не более 0,5 мм) или при помощи шприца;              сопоставлении колонок, заполненных сорбентом одного типа,
—при разделении на ВЭТСХ-пластинках для точного              но при помощи этой величины сопоставить разделяющую
дозирования     пробы      применять      микродозаторы-     способность различных колонок невозможно. Качество
аппликаторы, рассчитанные на объем в несколько               колонки удобнее определять по высоте, эквивалентной