Современные методы исследований в биохимии. Битуева А.В. - 26 стр.

тельность и может служить диагностическим маркером. ДНК-    гибридизовался    только     с    искомой     нуклеотидной
диагностика основывается на обнаружении известных           последовательностью.
нуклеотидных последовательностей и использует ряд быстрых
и надежных диагностических методов: гибридизация нук-            Если есть вероятность получения ложноположительного
леиновых кислот, полимеразная цепная реакция (ПЦР), метод   (наличие гибридизационного сигнала в отсутствие последова-
ПЦР/ЛОЗ, ПЦР в реальном времени.                            тельности-мишени) или ложноотрицательного (отсутствие
                                                            сигнала при наличии последовательности-мишени) результата,
            5.1.Гибридизация нуклеиновых кислот             то целесообразность применения теста значительно снижается.

                                                                 Специфичность зондов может проявляться на разных
    Гибридизация нуклеиновых кислот — спаривание двух
                                                            уровнях: они могут «различать» два и более вида, отдельные
комплементарных сегментов разных молекул ДНК
                                                            штаммы в пределах одного вида или разные гены. В
Процедура гибридизации состоит из:
                                                            зависимости от ситуации зонды могут быть представлены
1. Фиксации      одноцепочечной       ДНК-мишени       на   молекулами ДНК или РНК; они могут быть длинными (более
   мембранном фильтре.                                      100 нуклеотидов) или короткими (менее 50 нуклеотидов),
2. Нанесении      меченой       одноцепочечной      ДНК-    представлять     собой    продукт    химического    синтеза,
   зонда,    которая    при     определенных     условиях   клонированные интактные гены или их фрагменты.
   (температуре    и   ионной     силе)   спаривается   с        Наиболее удобно, чтобы ДНК-диагностику можно было
   ДНК-мишенью.                                             проводить на исходном материале, без дополнительного его
3. Промывании      фильтра    для     удаления    избытка   культивирования или выделения нуклеиновых кислот,
   несвязавшейся меченой ДНК-зонда.                         особенно в тех случаях, когда тестируются клинические образ-
4. Детекция гибридных молекул зонд/мишень.                  цы. В настоящее время с успехом проводят гибридиз ДНК-
                                                            мишенями, присутствующими в образцах кала, мочи, крови,
     В диагностических тестах, основанных на гибридизации   смывах из зева и в тканях без предварительной их очистки.
нуклеиновых кислот, ключевыми являются три компонента:      Если    концентрация       последовательности-мишени       в
ДНК-зонд,      ДНК-мишень        и     метод     детекции   исследуемом      образце    слишком     мала,   ее   можно
гибридизационного сигнала. Система детекции должна быть     амплифицировать с помощью полимеразной цепной
очень специфичной и высокочувствительной.                   реакции (ПЦР).

                 Гибридизационные зонды                                5.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

     Для обеспечения адекватности диагностического теста,         ПЦР - это метод, который позволяет найти в
гибридизационные ДНК- и РНК-зонды должны быть               исследуемом материале небольшой участок генетической
высокоспецифичными, т.е. необходимо, чтобы зонд             информации любого организма среди огромного количества
                                                            других участков и многократно размножить его.