Современные методы исследований в биохимии. Битуева А.В. - 27 стр.

                                                                                   Механизмы ПЦР
                         Принцип метода                           ПЦР состоит из 3 основных процедур: подготовки
       Метод ПЦР основан на принципе естественной          исследуемой пробы материала, которая в большинстве
репликации ДНК, включающем расплетение двойной спирали     случаев сводится к изоляции ДНК или РНК, собственно ПЦР
ДНК, расхождение нитей ДНК и комплементарное               и детекции продукта ПЦР (амплифицированной ДНК).
дополнение обеих. Репликация ДНК может начаться не в              Пятью основными компонентами ПЦР являются
любой точке, а только в определенных стартовых блоках -    следующие: а) фермент Taq-ДНК- полимераза; б) пара
коротких двунитевых участках. Суть метода заключается в    олигонуклеотидных       праймеров;       в)    4     типа
том, что, маркировав такими блоками специфический только   дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ); г) копируемая ДНК;
для данного вида (но не для других видов) участок ДНК,     д) ионы Mg+2. Вспомогательными компонентами являются
можно многократно воспроизвести (амплифицировать)          буферный раствор и минеральное масло.
именно этот участок.                                              Модельная система, используемая в ПЦР и
                                                           отражающая реальные биологические процессы репликации
      Для того чтобы осуществить такой процесс в           ДНК, включает три стадии:
пробирке, используют две генетические пробы, называемые        • денатурацию духцепочечной молекулы ДНК
праймерами, которые и служат в качестве затравки для              (расплетение двойной спирали, расхождение нитей
синтеза выбранного участка ДНК. При внесении в                    ДНК).
исследуемую пробу праймеры находят в растворе участок,         • гибридизацию (отжиг) праймеров с матричной ДНК
которому они комплементарны и, следовательно, способны            (образование двухцепочечных "комплексов" праймер-
присоединиться, образовав двунитчатый стартовый участок.          матрица, необходимых для инициации синтеза ДНК);
После присоединения (отжига) праймеров начинается              • достраивание          (удлинение,        элонгация)
воспроизведение с помощью фермента - Taq - полимеразы             комплиментарных цепей в направлении от 5' -конца к
специфического фрагмента ДНК. Вновь синтезированные               3' -концу цепи, начиная с участков присоединения
фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза               праймеров, при помощи ДНК-полимеразы.
новых нитей в следующем цикле амплификации - это и есть         Многократное (циклическое) повторение этих трех
цепная реакция в ПЦР. В результате количество копий        стадий приводит к экспоненциальному обогащению смеси
фрагмента увеличивается в геометрической прогрессии и      молекулами ДНК-мишени, поскольку в каждом новом цикле
через 25 циклов амплификации синтезируются 106 копий       в качестве матрицы выступает не только исходная ДНК, но и
фрагмента. В течение 30-40 циклов нарабатывается           ДНК, синтезированная в предыдущих циклах. Необходимо
количество ДНК, достаточное, чтобы визуально учитывать     примерно 30-35 циклов (это 108 молекул ампликонов) для
результаты реакции после электрофореза в агарозном геле.   достоверной визуальной детекции этого фрагмента методом
                                                           электрофореза в агарозном геле.