Современные методы исследований в биохимии. Битуева А.В. - 7 стр.

диаметра гранул (например, при уменьшении диаметра втрое   целлюлозы или сефадекса нельзя вносить в сухом виде — им
перепад давлений необходимо увеличить в 27 раз). Это       следует предварительно дать набухнуть. Для заполнения
предъявляет новые, повышенные требования к конструкции     предпочтительно использовать суспензию гранул в воде или
насосов, колонок, подводящих трубок и их сочленений, а     буфере в виде густой кашицы. Во всех случаях следует
также к жесткости самих гранул (сжатие гранул ведет к их   избегать свободного осаждения гранул из суспензии во
деформации, заполнению свободной площади сечения и         время заполнения колонки, так как это приведет к
закупориванию колонки). Как только возникла необходи-      распределению частиц по размерам как в продольном
мость убыстрения хроматографического анализа (например,    направлении, так и по сечению колонки, что обусловливает
для экспресс-анализа в заводских условиях), указанные      неоднородность последующего тока подвижной фазы. После
повышенные требования были осуществлены при разработке     заполнения фазам в колонке надо дать уравновеситься при
новой техники хроматографии при высоком давлении,          рабочей скорости элюции и соответствующем        перепаде
которую условились обозначать ЖХВД. Диаметр гранул для     давления.
ЖХВД оказалось возможным снизить 5 —10 мкм, что
позволило использовать колонки диаметром 2—5 мм и
уменьшить продолжительность хроматографического раз-
деления до десятков минут; при этом используют перепады                        Скорость элюции
давления порядка сотен атмосфер.                                С помощью теории миграции хроматографической
   Существенного снижения эффективного размера гранул      зоны можно получить выражение для оптимальной
неподвижной фазы и улучшения разрешения без                скорости элюции uопт; в первом приближении              оно
необходимости очень сильного повышения давления можно      сводится к очень простой зависимости uопт ≈ Dm/d, где Dm —
добиться путем использования в качестве неподвижной фазы   коэффициент диффузии вещества в подвижной фазе, a d —
сплошных (не пористых) гранул с сорбированным или          средний диаметр гранул. Для низкомолекулярных веществ в
химически закрепленным на них тонким слоем жидкости. Но    водных растворителях можно принять, что Dm≈10-5cm2/c.
при этом происходит снижение емкости колонки.              Тогда для колонки, заполненной гранулами со средним
                                                           диаметром 80 мкм, uопт составит 1,25·10-3 см/с или 4,5 мл/ч
                   Набивка колонки                         на 1 см2 сечения колонки. Рабочую скорость элюции можно
                                                           брать в 5 — 6 раз выше, чем uопт , т. е. примерно 20—30
     Практические исследования показывают, что в случае
                                                           мл/ч·см3. Для колонок ЖХВД с гранулами диаметром 10
ненабухающих (и несжимаемых) гранул на основе
                                                           мкм рабочую линейную скорость можно увеличить до 5· 10 -
спликагеля или пористого стекла наилучшие результаты       2
                                                             см/с, т. е. до 3 см/мин. При обычной высоте колонки (25
нередко дает заполнение колонки сухими гранулами.
                                                           см) это позволяет проводить хроматографическое фрак-
Колонку при этом следует потряхивать или постукивать по
                                                           ционирование за 8—10 мин.
ней. Первое заполнение ее жидкостью следует вести снизу
вверх, вытесняя воздух. Матрицы и сорбенты на основе