Современные методы исследований в биохимии. Битуева А.В. - 9 стр.

 сорбироваться в неподвижной фазе. Даже при отсутствии      сорбентом в случае обычной адсорбции или в ионообменной
 какой-либо сорбции, например при гель-фильтрации, увели-   системе приводит к ряду специфических особенностей
 чение молекулярного объема при денатурации может           взаимодействия вещества с сорбентом.
 приводить к задержанию молекул внутри гранул, откуда они        Во-первых,     начинает    сказываться   стерическое
 в нативном состоянии могли свободно диффундировать.        соответствие между ними, например близость средних
 Экспонирование гидрофобных участков может приводить к      расстояний между взаимодействующими (сорбционными,
 нежелательному взаимодействию фракционируемых молекул      ионогенными) группами на поверхности макромолекулы и на
 с самим материалом матрицы (полимерной сетки),             сорбенте, что диктует определенную конформационную
 образующей каркас гранул неподвижной фазы.                 избирательность процесса.
     Для уменьшения опасности денатурации нередко                Во-вторых, переход от прочной, почти полной сорбции
приходится вести хроматографию белков при пониженной        вещества в неподвижной фазе к его преимущественному
температуре или вводить в состав элюента глицерин в         нахождению в подвижной может быть очень резким. Этот
качестве консерванта, что приводит к увеличению вязкости    переход выражен тем резче, чем больше среднее число точек
жидкостей подвижной и неподвижной фаз, требует              закрепления, связывающих макромолекулу с сорбентом.
повышения рабочего давления и нередко ухудшает              Постепенное увеличение силы элюента (например,
разрешение за счет затруднения диффузии. С уменьшением      концентрации вытесняющей соли) может длительное время
коэффициентов диффузии снижается и допустимая скорость      оставаться без видимого эффекта, так как уменьшение
элюции,          увеличивается         продолжительность    среднего числа точек фиксации молекулы еще ее не
хроматографического процесса, а вместе с ней — и            освобождает. Затем, при достижении критического значения
вероятность денатурации. Следовательно, расширение зон и    данного    параметра    элюции,     происходит    быстрое
ухудшение разрешения пиков при             хроматографии    перераспределение вещества в пользу подвижной фазы.
макромолекул обусловлены главным образом трудностью            Это означает, в частности, что фракционирование
установления равновесия обмена между фазами. Это            макромолекул путем изократической элюции в большинстве
обстоятельство, в свою очередь, требует уменьшения ско-     случаев имеет мало шансов на успех. Подавляющее
рости элюции.                                               большинство макромолекул при данном выборе элюента
     В тех случаях, когда (при достаточно малых размерах    либо уже будет находиться в подвижной фазе, либо окажется
гранул) скорость элюции за счет повышенного давления        слишком прочно связанным с неподвижной фазой.
удается увеличить, не следует забывать о возможности        Непрерывная линейная градиентная элюция здесь удобнее,
денатурации макромолекул в результате их сжатия под         так как она для одного белка за другим создает ситуацию,
высоким давлением.                                          отвечающую быстрой десорбции.
     Важное для хроматографии различие между малыми            Сопоставляя непрерывную и ступенчатую градиентные
молекулами      и     биологическими     макромолекулами    элюции макромолекул, можно заключить, что первая из них,
обусловлено полиэлектролитным характером последних.         как правило, дает лучшее и более полное разрешение всех
Наличие нескольких точек связывания макромолекулы с         компонентов фракционируемой смеси — в результате