Современные методы исследований в биохимии. Битуева А.В. - 8 стр.

                   Загрузка колонки                          из них (например, белков) обусловлена третичной
                                                             структурой, в образовании которой решающую роль играют
     В целях наилучшего использования разрешающей
                                                             слабые силы взаимодействия между достаточно удаленными
возможности колонки ширина исходной зоны должна быть
                                                             друг    от    друга    участками   полипептидной   или
минимальной. Это не обязательно означает, что объем
                                                             полинуклеотидной цепи.
раствора препарата, вносимого на колонку, должен быть
мал. Такое      заключение   справедливо только для гель-          Кроме того, биологические макромолекулы являются
фильтрации, где сорбция препарата в неподвижной фазе         полиэлектролитами, что в случае ионных взаимодействий с
отсутствует. Если же сродство хроматографируемого            сорбентом приводит к многоточечному контакту. Часто на
вещества к неподвижной фазе велико, как, например, при       их поверхности мозаично расположены гидрофобные и
ионообменной хроматографии, то узкая исходная зона на        гидрофильные участки, а также центры сорбции.
верхнем конце колонки образуется сама в процессе нанесения   Биологическая активность многих ферментов связана с
препарата даже из большого объема            разбавленного   сохранением четвертичной структуры, когда белковая
раствора.                                                    молекула состоит из нековалентно связанных между собой
     С другой стороны, следует проявлять осторожность при    субъединиц.
внесении на колонку препарата в виде концентрированного
                                                                   Термином «денатурация» обычно обозначают утрату
раствора. Помимо проблемы повышенной вязкости такого
                                                              макромолекулами четвертичной, третичной или вторичной
раствора, не исключено, что условия в исходной зоне будут
                                                              структурных организаций. Такая утрата может происходить
неблагоприятно влиять на разрешении пиков. В результате
                                                              в ходе самого хроматографического процесса — как в
зона разрешения деформируется (ее передний фронт будет
                                                              результате воздействия элюента (экстремальные значения
становиться все более крутым, а задний — растянется) и
                                                              рН, высокие концентрации соли, возможность окисления),
приобретет профиль с образованием размытого «хвоста», что
                                                              так и вследствие многоточечной сорбции, когда
достаточно часто встречается в хроматографической
                                                              макромолекулы как бы «распластываются» на поверхности
практике. Эта деформация может быть следствием
                                                              сорбента. При этом слабые связи между участками их цепей
перегрузки зоны, а также в случае слишком большой
                                                              разрываются. Денатурация, как правило, приводит к
скорости элюции, разрешение этой альтернативы возможно
                                                              увеличению молекулярного объема и к экспонированию
за счет уменьшения скорости элюции при той же загрузке
                                                              гидрофобных участков, особенно у белков, где эти участки в
колонки.
                                                              большинстве своем укрыты от контакта с водно-солевой
                                                              средой клетки, располагаясь внутри белковых глобул. Такие
         ХРОМАТОГРАФИЯ МАКРОМОЛЕКУЛ                           изменения при денатурации влияют на распределение
                                                              макромолекул между подвижной и неподвижной фазами.
     Макромолекулы отличаются от малых молекул не             Это влияние нередко бывает неблагоприятным, поскольку
только размерами, но и лабильностью, которая в первую         развернутые полипептидные или полинуклеотидные цепи
очередь связана с тем, что биологическая активность многих    склонны очень прочно, а иногда и необратимо