Современные методы исследований в биохимии. Битуева А.В - 28 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

ВСГУТУ | Улан-Удэ

Составители: 

Рубрика: 

21. Надосадочную жидкость (экстракт ДНК) целиком
перенести в чистую пробирку. Хранить полученный
экстракт ДНК при температуре -20˚С, при частом
использовании – при температуре +4ºС.
NB! Надосадочная жидкость используется в качестве
пробы ДНК для проведения ПЦР. Избегайте попадания
в нее сорбента.
1.2. Пробоподготовка
На примере метода, разработанного с использованием
наборов TaqMan для анализа сои ("TaqMan GMO Soy Detection
Kit") и кукурузы ("TaqMan GMO Maize Detection Kit"):
Метод выделения ДНК с помощью СТАБ
(гексадецилтриметиламмониум бромид).
Приготовление растворов
• СТАБ-буфер.
В мерную колбу вносят 4 г СТАБ; 16,4 г NaCl; 3,15 г ТРИС
- НС1; 1,5 г Na
2
ЭДTA, добавляют 100 мл деионизированной
воды, доводят рН раствора до 8,0 1 М NaOH, доводят объем
деионизированной водой до 200 см
3
.
Хранить при 4 °С не более 6 месяцев.
Перед использованием раствор выдерживают при
комнатной температуре или подогревают в термостате при
температуре 65 °С до полного растворения осадка.
Непосредственно перед использованием в приготовленный
лизирующий буфер вносят 2-меркаптоэтанол из расчета 4 мм
3
на 1 см
3
лизирующего буфера и перемешивают.
• СТАБ-осаждающий раствор.
В мерную колбу вносят 1 г СТАБ; 0,5 г NaCl, добавляют 100
см
3
деионизированной воды, доводят рН раствора до 8,0 1 М
NaOH, доводят объем деионизированной водой до 200 см
3
.
Хранить при 4 °С не более 6 месяцев.
• 1,2 М NaCl.
Растворяют 7,0 г NaCl в 100 см
3
деионизированной
воды, перемешивают.
Хранить в колбе с притертой пробкой при
комнатной температуре до 1 года.
Приготовленные растворы автоклавируют при 1
атм., 121 °С 15 - 20 мин. или фильтруют через мембраны
Millipore 0,4 мм
• 70%-ный раствор этилового ректификованного
спирта.
Смешивают 70 см
3
96%-ного этилового
ректификованного спирта с 26 см
3
деионизированной
воды.
Хранить при температуре от 4 до 5 °С не более 2
мес. в темной склянке.
Процедура выделения ДНК
. Навеску исследуемого гомогенизированного
продукта массой 100 мг помещают в
микроцентрифужную пробирку типа Эппендорф на 1,5
см
3
.
. Добавляют 300 мм
3
деионизированной воды,
перемешивают шпателем.
• Добавляют 500 мм
3
СТАБ-буфера с
меркаптоэтанолом, тщательно перемешивают шпателем.
. Инкубируют при 65 °С 90 мин.
.Центрифугируют 10 мин. на настольной
микроцентрифуге типа Эппендорф при частоте вращения
13000 об.мин.
• Переносят 500 мм
3
супернатанта в чистую
пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 см
3
.
. Добавляют 500 мм
3
хлороформа, перемешивают на
аппарате для встряхивания типа "Вортекс" 30 с.
. Центрифугируют 10 мин. при частоте вращения 
21. Надосадочную жидкость (экстракт ДНК) целиком                       Растворяют 7,0 г NaCl в 100 см3 деионизированной
    перенести в чистую пробирку. Хранить полученный              воды, перемешивают.
    экстракт ДНК при температуре -20˚С, при частом                     Хранить в колбе с притертой пробкой при
    использовании – при температуре +4ºС.                        комнатной температуре до 1 года.
NB! Надосадочная жидкость используется в качестве                      Приготовленные растворы автоклавируют при 1
   пробы ДНК для проведения ПЦР. Избегайте попадания             атм., 121 °С 15 - 20 мин. или фильтруют через мембраны
   в нее сорбента.                                               Millipore 0,4 мм
                                                                       • 70%-ный раствор этилового ректификованного
   1.2. Пробоподготовка                                          спирта.
                                                                       Смешивают       70    см3   96%-ного    этилового
    На примере метода, разработанного с использованием           ректификованного спирта с 26 см3 деионизированной
наборов TaqMan для анализа сои ("TaqMan GMO Soy Detection        воды.
Kit") и кукурузы ("TaqMan GMO Maize Detection Kit"):                   Хранить при температуре от 4 до 5 °С не более 2
    Метод      выделения   ДНК     с    помощью      СТАБ        мес. в темной склянке.
(гексадецилтриметиламмониум бромид).
                Приготовление растворов
• СТАБ-буфер.                                                                   Процедура выделения ДНК
     В мерную колбу вносят 4 г СТАБ; 16,4 г NaCl; 3,15 г ТРИС         . Навеску исследуемого гомогенизированного
- НС1; 1,5 г Na2ЭДTA, добавляют 100 мл деионизированной          продукта      массой     100    мг     помещают    в
воды, доводят рН раствора до 8,0 1 М NaOH, доводят объем         микроцентрифужную пробирку типа Эппендорф на 1,5
деионизированной водой до 200 см3.                               см3.
     Хранить при 4 °С не более 6 месяцев.                             . Добавляют 300 мм3 деионизированной воды,
     Перед использованием раствор выдерживают при                перемешивают шпателем.
комнатной температуре или подогревают в термостате при                • Добавляют      500    мм3     СТАБ-буфера   с
температуре 65 °С до полного растворения осадка.                 меркаптоэтанолом, тщательно перемешивают шпателем.
Непосредственно перед использованием в приготовленный                 . Инкубируют при 65 °С 90 мин.
лизирующий буфер вносят 2-меркаптоэтанол из расчета 4 мм3             .Центрифугируют 10 мин. на настольной
на 1 см3 лизирующего буфера и перемешивают.                      микроцентрифуге типа Эппендорф при частоте вращения
• СТАБ-осаждающий раствор.                                       13000 об.мин.
     В мерную колбу вносят 1 г СТАБ; 0,5 г NaCl, добавляют 100        • Переносят 500 мм3 супернатанта в чистую
   3
 см деионизированной воды, доводят рН раствора до 8,0 1 М        пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 см3.
 NaOH, доводят объем деионизированной водой до 200 см3.               . Добавляют 500 мм3 хлороформа, перемешивают на
      Хранить при 4 °С не более 6 месяцев.                       аппарате для встряхивания типа "Вортекс" 30 с.
      • 1,2 М NaCl.                                                   . Центрифугируют 10 мин. при частоте вращения

Страницы