Современные методы исследований в биохимии. Битуева А.В - 29 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

ВСГУТУ | Улан-Удэ

Составители: 

Рубрика: 

13000 об.мин.
. Переносят 500 мм
3
верхней фракции в чистую пробирку,
добавляют 500 мм хлороформа, перемешивают.
. Центрифугируют 5 мин. при частоте вращения 13000
об.мин.
• Переносят верхнюю фракцию в чистую пробирку типа
Эппендорф вместимостью 1,5 см
3
, не захватывая слой
хлороформа.
. Добавляют 2 объема СТАБ-осаждающего буфера,
перемешивают пипетированием.
. Инкубируют 60 мин. при комнатной температуре.
. Центрифугируют 5 мин. при частоте вращения 13000
об.мин.
. Удаляют супернатант.
. Растворяют осадок в 350 мм
3
NaCl (1,2 М).
. Добавляют 350 мм
3
хлороформа, перемешивают на
аппарате для встряхивания типа "Вортекс" 30 с.
• Центрифугируют 10 мин. при частоте вращения 13000
об.мин.
• Переносят верхнюю фракцию в чистую пробирку типа
Эппендорф вместимостью 1,5 см
3
.
• Добавляют 0,6 объема изопропилового спирта,
перемешивают.
. Центрифугируют 10 мин. при частоте вращения 13000
обУмин.
. Удаляют супернатант.
. Добавляют 500 мм
3
70%-ного раствора этилового спирта и
перемешивают на аппарате для встряхивания типа "Вортекс".
. Центрифугируют 10 мин. при частоте вращения 13000
об.мин.
. Удаляют супернатант.
.Подсушивают осадок не более 5 мин. при 65 °С для
удаления капель спирта.
. Растворяют осадок в 100 мм
3
деионизированной воды,
осторожно встряхивая.
. Полученный раствор ДНК готов для проведения
ПЦР, хранить при минус 20 °С.
2. Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР)
1. Перед началом работы продизенфицировать УФ-
бокс для ПЦР или ламинарный шкаф, включив
ультрафиолетовые лампы и вытяжку в нем на 15-20
мин. Все оборудование и расходные материалы,
предназначенные непосредственно для ПЦР
(амплификатор, микроцентрифуга-вортекс,
комплект микродозаторов, штатив с
наконечниками, штатив для пробирок до 0,5 мл)
должны постоянно находиться в УФ-боксе, и ни в
коем случае не использоваться для других целей
помимо приготовления ПЦР смеси и проведения
амплификации.
2. Извлечь из пакета необходимое количество
пробирок “ПЦР ядро” по числу анализируемых
проб, плюс положительный и отрицательный
контроли и разместить их в штативе.
3. Добавить в пробирки “ПЦР ядро” по 10 мкл ПЦР
растворителя и по 5 мкл Смеси праймеров.
Дождаться, пока полностью растворится сухое
содержимое пробирок “ПЦР ядро”, обычно для
этого требуется 5-10 мин. Содержимое пробирок
перемешать путем легкого встряхивания до
равномерного окрашивания жидкости в синий цвет.
4. Добавить в пробирки “ПЦР ядро” с ПЦР смесью
по…
4.1. …5 мкл пробы ДНК каждого из исследуемых
образцов. При переходе от пробы к пробе 
13000 об.мин.                                                         . Полученный раствор ДНК готов для проведения
      . Переносят 500 мм3 верхней фракции в чистую пробирку,      ПЦР, хранить при минус 20 °С.
добавляют 500 мм хлороформа, перемешивают.
      . Центрифугируют 5 мин. при частоте вращения 13000          2. Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР)
об.мин.
      • Переносят верхнюю фракцию в чистую пробирку типа          1. Перед началом работы продизенфицировать УФ-
Эппендорф вместимостью 1,5 см3, не захватывая слой                   бокс для ПЦР или ламинарный шкаф, включив
хлороформа.                                                          ультрафиолетовые лампы и вытяжку в нем на 15-20
      . Добавляют 2 объема СТАБ-осаждающего буфера,                  мин. Все оборудование и расходные материалы,
 перемешивают пипетированием.                                        предназначенные непосредственно для ПЦР
      . Инкубируют 60 мин. при комнатной температуре.                (амплификатор,        микроцентрифуга-вортекс,
      . Центрифугируют 5 мин. при частоте вращения 13000             комплект     микродозаторов,      штатив      с
об.мин.                                                              наконечниками, штатив для пробирок до 0,5 мл)
      . Удаляют супернатант.                                         должны постоянно находиться в УФ-боксе, и ни в
      . Растворяют осадок в 350 мм3 NaCl (1,2 М).                    коем случае не использоваться для других целей
       . Добавляют 350 мм3 хлороформа, перемешивают на               помимо приготовления ПЦР смеси и проведения
 аппарате для встряхивания типа "Вортекс" 30 с.                      амплификации.
           • Центрифугируют 10 мин. при частоте вращения 13000
     об.мин.                                                      2. Извлечь из пакета необходимое количество
      • Переносят верхнюю фракцию в чистую пробирку типа             пробирок “ПЦР ядро” по числу анализируемых
Эппендорф вместимостью 1,5 см3.                                      проб, плюс положительный и отрицательный
      • Добавляют 0,6 объема изопропилового спирта,                  контроли и разместить их в штативе.
перемешивают.
  . Центрифугируют 10 мин. при частоте вращения 13000             3. Добавить в пробирки “ПЦР ядро” по 10 мкл ПЦР
обУмин.                                                              растворителя и по 5 мкл Смеси праймеров.
. Удаляют супернатант.                                               Дождаться, пока полностью растворится сухое
       . Добавляют 500 мм3 70%-ного раствора этилового спирта и      содержимое пробирок “ПЦР ядро”, обычно для
 перемешивают на аппарате для встряхивания типа "Вортекс".           этого требуется 5-10 мин. Содержимое пробирок
      . Центрифугируют 10 мин. при частоте вращения 13000            перемешать путем легкого встряхивания до
об.мин.                                                              равномерного окрашивания жидкости в синий цвет.
      . Удаляют супернатант.
       .Подсушивают осадок не более 5 мин. при 65 °С для          4. Добавить в пробирки “ПЦР ядро” с ПЦР смесью
 удаления капель спирта.                                              по…
       . Растворяют осадок в 100 мм3 деионизированной воды,       4.1. …5 мкл пробы ДНК каждого из исследуемых
 осторожно встряхивая.                                                  образцов. При переходе от пробы к пробе

Страницы