Лекции по генетике человека. Буторина А.К - 28 стр.

                                    28
рекомбинантного вектора. Генная терапия in vivo          - это очень
перспективный подход, рассчитанный на массовое лечение широко
распространенных заболеваний, однако пока он апробирован только для
лечения муковисцидоза.
      В настоящее время разрабатываются другие подходы к генной
терапии: методы направленной модификации генов, супрессия
(подавление) конкретных мутаций. Однако такие эксперименты
проводятся пока с целью создания трансгенных животных и
биологического моделирования на молекулярном уровне патологических
процессов и разработки методов адекватного лечения на животных с
определенными специфическими, но не наследственными изменениями.
      Направленное выключение генов-мишеней может быть достигнуто
несколькими способами. Так называемые нулевые мутации могут быть
получены путем встраивания плазмиды, содержащей наряду с экзонными
последовательностями модифицируемого гена и селектируемым
маркерным геном сильные транскрипционные и трансляционные стоп-
сигналы. При этом в разрушенном за счет инсерции экзоне транскрипция
прекращается, в результате чего образуется укороченный белок, не
защищенный от действия клеточных протеаз.
      Более совершенной является техника двойной замены гена. Для
этого используются эмбриональные стволовые клетки (культура клеток,
полученная из бластоцисты или первичных половых клеток ранних
постимплантационных       зародышей),    дефицитные    по   ферменту
гипоксантинфосфорибозилтрансферазы (ген HPRT). На первом этапе ген-
мишень инактивируют путем замены одного из экзонов и прилежащих
последовательностей на HPRT-мини-ген. При этом в нокаутируемом
векторе    HPRT-маркер      фланкируется    ДНК-последовательностями,
гомологичными месту вставки в ДНК гена-мишени. В этот же ген
включен и ген вирусной тимидининазы. После трансфекции отбирают
клетки, позитивные по HPRT и негативные по вирусной тимидинкиназе.
Именно в таких клетках с высокой степенью вероятности произошла
гомологичная рекомбинация с заменой одного из экзонов на
инсертированный мини-ген HPRT. Факт этого встраивания доказывается
при помощи ПЦР. При этом           олигопраймеры для амплификации
выбирают таким образом, что один из них гомологичен соседней с сайтом
интеграции последовательности модифицируемого гена, а другой
соответствует участку инсертируемой экзогенной ДНК. Такой метод
позволяет обнаруживать присутствие пяти правильно модифицированных
клеток среди 50000. На следующем этапе инсертированный HPRT-мини-
ген заменяют на отсутствующий фрагмент гена-мишени, в который
предварительно вносят интересующие исследователя мутации. При этом
альтернативный     вектор    несет   те   же   фланкирующие     ДНК-
последовательности гена-мишени, что и первый (нокаутирующий) вектор.
В результате гомологичной рекомбинации происходит замена мини-HPRT-
гена на альтернативный фрагмент исходного гена. Факт такой
рекомбинации контролируется с помощью ПЦР. Таким образом, вместо