Лекции по генетике человека. Буторина А.К - 29 стр.

                                   29
обычного выключения функции гена, что достигается уже на первом этапе,
данная технология позволяет вносить в структуру гена дикого типа
различные, заранее спланированные изменения.
      Основные векторные системы
      Как правило, вводимая генетическая конструкция представляет
собой полноразмерную кДНК определенного гена, инсертированную в
экспрессный вектор, т.е. находящуюся под действием сильного промотора.
Выбор подходящего промотора зависит от многих параметров, главным из
которых является необходимый уровень экспрессии гена в клетках-
мишенях. Вектор часто содержит один из маркерных генов, таких как гены
neo (прокариотический ген, обеспечивающий устойчивость к неомицину),
ген люциферазы и другие, присутствие которых в трансдуцированных
клетках может быть легко обнаружено либо по наличию
соответствующего белкового продукта (гистохимически для гена
люциферазы), либо маркерных последовательностей ДНК. Если в качестве
маркера    выбран     селектируемый    ген    (neo),   отбор   клеток,
трансфецированных in vitro, может производиться автоматически на
соответствующих селективных средах. Существует два типа конструкций;
один – на основе плазмидной ДНК, другой - на базе вирусов. Плазмидные
конструкции удобны для клонирования, генно-инженерных манипуляций и
получения большого количества рекомбинантной ДНК. Однако
бактериальные плазмиды, в отличие от вирусных конструкций, не
способны самостоятельно проникать в эукариотические клетки. Для
введения инсертированной в плазмиду экзогенной ДНК в клетки человека
необходимо перенести ее в подходящий вирусный вектор или применить
способ, облегчающий ее прохождение через клеточные мембраны.
      Примеры практического применения генной терапии
      Первым моногенным наследственным заболеванием, в отношении
которого были применены методы генной терапии, оказался
наследственный иммунодефицит, обусловленный мутацией в гене
аденозиндезаминазы (ген ADA). При этом заболевании в крови
накапливается в высокой концентрации 2’-дезоксиаденозин, оказывающий
токсическое воздействие на Т- и В-лимфоциты. Пациенты не переносят
никаких контактов с любой инфекцией из-за тотального отсутствия
иммунитета. План генной терапии заключался в назначении больным
аутологичных лимфоцитов, трансдуцированных нормальным ADA-геном.
Осуществление этого плана потребовало выполнение следующих
процедур: изоляции клеток из крови пациента; активации и
иммуностимуляции роста Т-лимфоцитов в культуре; трандукции их
ретровирусным вектором, несущим нормальный ADA-ген и маркерный ген
neo; отбора трансдуцированных клеток на селективной среде;
внутривенной реинфузии модифицированных Т-лимфоцитов пациенту.
Первой пациенткой, подвергшейся этой терапии, была 4-летняя девочка.
Это событие, которое считается «днем рождения» генной терапии,
произошло 14 сентября 1990 года в г. Бетезде (США). С этого года стал
издаваться журнал «Генная терапия». На протяжении 10,5 месяцев