Физиологические и биохимические методы анализа растений. Чупахин Г.Н. - 26 стр.

    Навеску растительного материала 200-500 мг растирают в фарфоровой
ступке с небольшим количеством фосфатного буфера и переносят в мер-
ную колбу на 25 см3, доводят буфером до метки и через 10 минут настаи-
вания экстракт центрифугируют при 4000-6000 об/мин в течение 10 ми-
нут.
    В опытную кювету спектрофотометра с рабочей длиной 1 см вносят
0,5 см3 субстрата, 1,5 см3 буферного раствора, 0,5 см3 ферментной вытяжки
(центрифугата) и 0,5 см3 раствора перекиси водорода. С внесением первой
капли перекиси водорода включают секундомер. Первое измерение прово-
дят через 20 с. Отсчеты снимают несколько раз через 20 с в течение 1-2 мин
или другого интервала времени. Предварительно устанавливают в нулевом
положении стрелку амперметра прибора по контрольной кювете, в кото-
рую вносят компоненты реакционной смеси, но вместо перекиси водорода
- такое же количество воды (0,5 см3). Оптическую плотность растворов
измеряют при 470 нм (максимум поглощения тетрагваякола). Активность А
выражают в относительных единицах на 1 г сырой массы (или на единицу
белка) по формуле:
                                                   60
                       A = (D 2 − D1 )VV2 ×                  ,
                                            ( t 2 − t 1 )V1н
где D1 - оптическая плотность раствора в начале опыта (первое измерение);
    D2 - оптическая плотность раствора в конце опыта;
    t1 и t2 - время начала и конца опыта, с; н- масса навески, г; V- общий
исходный объём вытяжки, см3;
    V1 - объём, взятый для проведения реакции, см3;
    V2 - общий объём жидкости в кювете, см3;
    60 - коэффициент перевода в минуты.

                Колориметрический метод определения
                      активности пероксидазы
                           (по А.М. Бояркину)
   Метод основан на определении скорости реакции окисления бензидина
до образования синего продукта окисления определённой концентрации,
заранее устанавливаемой на фотоэлектроколориметре [1].
                        Реактивы и аппаратура
   1. Ацетатный буфер с рН 5,4.
   2. Раствор бензидина на ацетатном буфере (в мерную колбу на 200 см3
наливают примерно 100 см3 дистиллированной воды, прибавляют 2,3 см3
ледяной уксусной кислоты и 184 мг бензидина; колбу нагревают на водя-
ной бане при 60oC, постоянно взбалтывая; после полного растворения бен-


                                                                        25