Физиологические и биохимические методы анализа растений. Чупахин Г.Н. - 28 стр.

      СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ
            АКТИВНОСТИ ЦИТОХРОМОКСИДАЗЫ
   Цитохромоксидаза - основная терминальная оксидаза. Фермент локали-
зован главным образом в митохондриях, в качестве простетической группы
содержит гематин. В составе цитохромоксидазы кроме железа гема обна-
ружена и медь. Цитохромоксидаза осуществляет окисление восстановлен-
ных цитохромов. Активность этого фермента определяют спектрофото-
метрическим методом, который основан на измерении оптической плотно-
сти раствора восстановленного цитохрома с, имеющего максимум погло-
щения при 550 нм [1]. Показателем активности служит величина падения
оптической плотности раствора за определённый промежуток времени.
                                Реактивы
   1. 0,15 М фосфатный буфер с рН 7,4.
   2. Восстановленный 2,5.10-5- 5.10-5М раствор цитохрома с; вначале го-
товят исходный раствор цитохрома с (например, 52 мг растворяют в 25 см3
бидистиллированной воды), затем берут 3 см3 приготовленного раствора и
смешивают его с 17 см 3 буфера с рН 7,4, восстанавливают смесь неболь-
шим количеством (70 мг) гидросульфита (на кончике ланцета), при этом
образуется розовая окраска; избыток гидросульфита удаляется окислением
кислородом воздуха путём встряхивания в течение 5-10 мин; получение
восстановленного раствора цитохрома является важным моментом; про-
верка степени восстановления может быть проведена на спектрофотометре
по Смиту [2].
   3. Красная кровяная соль - K3[Fe(CN)6] (ферроцианид калия).
                               Ход анализа
   Навеску растительного материала массой 400-600 мг тщательно расти-
рают в охлажденной ступке с холодным фосфатным буфером с pH 7,4.
Растертую массу переносят в мерную колбу емкостью 50 см3 и доводят
фосфатным буфером до метки. Вытяжку центрифугируют в течение 15
минут при 3000-4000 об/мин на центрифуге с охлаждением. Для определе-
ний используют охлажденный центрифугат. Все ферментные вытяжки
(центрифугаты) до измерения должны находиться в сосуде со льдом. Из-
мерение оптической плотности опытного раствора проводят при 550 нм.
Вначале по контрольному образцу устанавливают стрелку амперметра
прибора в нулевом положении. Контрольный образец содержит 1,5 см3 вы-
тяжки и 1,5 см3 фосфатного буфера с рН 7,4. При работе с митохондриями
берут их взвесь в фосфатном буфере и среду выделения в соотношении 1:2
или 2:1 (общий объём 1,5 см3) и добавляют 1,5 см3 буферного раствора.


                                                                      27