Физиологические и биохимические методы анализа растений. Чупахин Г.Н. - 30 стр.

    При работе с фенолазами следует иметь в виду, что для создания усло-
вий, препятствующих реагированию эндогенных фенолов с белками и
ферментами, необходимо добавлять на первых этапах гомогенизации тка-
ни полиамид. Обычно соотношение между навеской сырой ткани и поли-
амидом 1: 0,5 или 1:1 (получение полиамида см. в приложении).
    Активность полифенолоксидазы определяют спектрофотометрическим
методом [1], который основан на измерении оптической плотности про-
дуктов реакции, образовавшихся при окислении пирокатехина (или друго-
го субстрата) за определённый промежуток времени.
                                Реактивы
    1. 1/15 М фосфатный буфер с рН 7,4.
    2. 0,05 М раствор пирокатехина.
                               Ход анализа
    Навеску растительного материала массой 100-200 мг растирают в фар-
форовой ступке в присутствии полиамида (50-100 мг) и буферного раство-
ра, переносят в мерную колбу на 25 см3 и доводят буферным раствором до
метки. Центрифугируют при 4000 об/мин в течение 10 мин. При работе с
белковыми (ацетоновыми) препаратами фермента готовят растворы с кон-
центрацией белка 20-30 мг/см3.
    В опытную кювету спектрофотометра вносят 0,5 см3 ферментной вы-
тяжки, 2,0 см3 фосфатного буфера с рН 7,4 и 0,5 см3 раствора пирокатехи-
на. С первой каплей пирокатехина включают секундомер. Первое измере-
ние проводят через 20 с. Отсчеты снимают несколько раз через 20 с в тече-
ние 2 мин (или другого времени).
    Предварительно устанавливают нулевое положение стрелки ампермет-
ра прибора по контрольной кювете, в которую вносят те же компоненты
реакционной смеси, но вместо пирокатехина приливают 0,5 см3 Н2О. Оп-
тическую плотность измеряют при 420 нм. Активность выражают в отно-
сительных единицах на 1 г сырой ткани или на единицу белка за 1 мин.
Расчет производят по формуле:
                              (D 2 − D1 )60VV2
                         A=                      ,
                                ( t 2 − t 1 )V1H
где D1 - оптическая плотность           раствора в начале опыта (первое
измерение);
   D2 - оптическая плотность раствора в конце опыта;
   t1 и t2 - время в начале и в конце опыта, с;
   Н - масса навески, г;
   V - общий объём ферментной вытяжки, см3;
   V1 - объём, взятый для проведения реакции, см3;
                                                                       29