Физиологические и биохимические методы анализа растений. Чупахин Г.Н. - 38 стр.

экстракцию смесью этанол-серный эфир (3:1) при комнатной температуре
до полного извлечения пигментов. Последний раз остаток промывают эфи-
ром и высушивают в вакуум-эксикаторе. Подготовленная таким образом
растительная масса используется для определения нуклеиновых кислот.
    Остаток после извлечения кислоторастворимого и липидного фосфора
заливают 0,5 н. KOH (или NaOH) из расчета 10 мл щелочи на 100 мг остат-
ка и выдерживают при 37° С в течение часа. Затем охлаждают и центрифу-
гируют 15 минут при 4000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают и ста-
вят в холодильник, а осадок после промывания холодным 0,5 н. КОН от-
брасывают. Прозрачные центрифугаты объединяют и нейтрализуют на ле-
дяной бане холодной 57%-ной HClO4 по фенолфталеину. Затем концентра-
цию раствора этой кислоты доводят до 5% ее содержания. На холоде вы-
падает осадок ДНК, а в растворе остается РНК. Через 20 минут осадок от-
деляют центрифугированием и два раза (по 5 мл) промывают охлажденной
5%-ной HClO4. Центрифугаты, содержащие РНК, объединяют в кониче-
ской колбочке на 50 мл, закрывают обратным воздушным холодильником
и гидролизуют на кипящей водяной бане в течение 15 минут. Затем охлаж-
дают и фильтруют через стеклянный фильтр №4 или через обеззоленный
“мелкопористый” фильтр. Объем прозрачного фильтрата измеряют и ис-
пользуют для спектрофотометрического определения фосфора РНК.
    Осадок ДНК с помощью 5%-ной HClO4 переносят в коническую кол-
бочку на 50 мл, закрывают обратным воздушным холодильником и гидро-
лизуют 30 минут на кипящей водяной бане. После охлаждения и центри-
фугирования жидкость сливают в мерную колбочку, а осадок промывают
небольшим количеством 5%-ной HClO4, центрифугируют и надосадочную
жидкость присоединяют к первому центрифугату, объем доводят до метки
или просто измеряют. Прозрачный раствор спектрофотометрируют. В ка-
честве контроля, против которого измеряют оптическую плотность опыт-
ного раствора, берут 5%-ный раствор HClO4. Оптическую плотность полу-
ченных опытных растворов измеряют при 270 и 290 нм.
    Вычисление концентрации фосфора нуклеиновых кислот (Х) произво-
дят по формуле:
                              Е − Е 290
                          Х = 270       мг/мл,
                                 190
где Е - оптическая плотность растворов при соответствующей длине вол-
ны. Деление на 190 дает количество фосфора нуклеиновой кислоты в 1 мл
раствора.
                           Пример расчета
   При спектрофотометрировании раствора РНК найдена Е270 = 836, а Е290
= 506. Объем раствора РНК составлял 100 мл. Перед определением оптиче-

                                                                     37