Идентификация и исследование экспрессии генов. Епринцев А.Т - 45 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

ВГУ | Воронеж

Составители: 

Рубрика: 

45
3) Перемешать компоненты на вортексе и установить следующий цикл
амплификации:
1.
Первичная денатурация при 94
о
С – 1 мин;
2.
Денатурация цикла при 94 °С – 10 с;
3.
Отжиг праймеров при 37–68 °С – 10 с;
4.
Элонгация при 72 °С – 10–60 с (в зависимости от длины
получаемого продукта);
5.
Повтор цикла амплификации (этапы со 2 по 4) 40 раз.
6.
Время инкубации после последнего этапа при 72 °С – 3 мин.
Работа 14. Использование биотин-11-dUTP для нерадиоактивного ме-
чения ДНК методом удлинения затравки
1. В пробирку внесите следующие компоненты в указанном порядке:
– матричная ДНК (50-100 нг) – 5.0 мкл,
– 10х реакционный буфер – 2.5 мкл,
– гексануклеотидная затравка – 2.5 мкл,
– деионизированная вода – 6.0 мкл.
2. Встряхните пробирку на вортексе и собирите капли центрифугированием.
3. Инкубируйте пробу 5–10 мин в кипящей водяной бане для денатурации
ДНК и затем быстро перенесите пробирку в лед
. Соберите капли центри-
фугированием.
4. Добавьте к пробе следующие компоненты:
– смесь дНТФ с биотин-11-dUTP – 8.0 мкл,
– ДНК-полимеразу: фрагмент Кленова – 1.0 мкл или термостабиль-
ная полимераза – 0.5 мкл.
5. Инкубируйте пробу в течение часа при 37 °С при использовании фраг-
мента Кленова или при 45 °С при использовании термостабильной поли-
меразы. 
  3) Перемешать компоненты на вортексе и установить следующий цикл
     амплификации:
          1.    Первичная денатурация при 94 оС – 1 мин;
          2.    Денатурация цикла при 94 °С – 10 с;
          3.    Отжиг праймеров при 37–68 °С – 10 с;
          4.    Элонгация при 72 °С – 10–60 с (в зависимости от длины
                получаемого продукта);
          5.    Повтор цикла амплификации (этапы со 2 по 4) 40 раз.
          6.    Время инкубации после последнего этапа при 72 °С – 3 мин.


Работа 14. Использование биотин-11-dUTP для нерадиоактивного ме-
чения ДНК методом удлинения затравки


1. В пробирку внесите следующие компоненты в указанном порядке:
     – матричная ДНК (50-100 нг)         – 5.0 мкл,
     – 10х реакционный буфер             – 2.5 мкл,
     – гексануклеотидная затравка        – 2.5 мкл,
     – деионизированная вода             – 6.0 мкл.
2. Встряхните пробирку на вортексе и собирите капли центрифугированием.
3. Инкубируйте пробу 5–10 мин в кипящей водяной бане для денатурации
ДНК и затем быстро перенесите пробирку в лед. Соберите капли центри-
фугированием.
4. Добавьте к пробе следующие компоненты:
     – смесь дНТФ с биотин-11-dUTP – 8.0 мкл,
     – ДНК-полимеразу: фрагмент Кленова – 1.0 мкл или термостабиль-
ная полимераза – 0.5 мкл.
5. Инкубируйте пробу в течение часа при 37 °С при использовании фраг-
мента Кленова или при 45 °С при использовании термостабильной поли-
меразы.
                                    45

Страницы