Идентификация и исследование экспрессии генов. Епринцев А.Т - 46 стр.

6. Остановите реакцию добавлением 1 мкл 0.5М ЭДТА рН 8.0.
7. Полученную меченую ДНК можно использовать сразу или храните при –
20 °С. Еще лучше переосадить меченую ДНК. Для этого к реакционной
смеси (25 мкл) добавьте 8 мкл 7 М ацетата аммония, 100 мкл этанола, хо-
рошо перемешайте и оставьте минимум на 30 мин при –70 °С или на 2 часа
при –20 °С.
8. Отцентрифугируйте при 12 000 об/мин в течение 10 мин, промойте оса-
док холодным 70 % этанолом, высушите под вакуумом и растворите в под-
ходящем объеме воды или ТЕ буфера.
Комментарии к методике:
1) Повысить включение меченого основания можно, оставляя реакционную смесь для
   инкубации на ночь при 37 °С или при комнатной температуре (~22 °С). Инкубация
   при комнатной температуре продлевает жизнь фермента (фрагмента Кленова) и де-
   лает включение более эффективным.
2) Количество синтезированной меченой ДНК зависит не только от чистоты, но и от
   количества взятой в реакцию матричной ДНК.
3) При использовании термостабильной полимеразы добиться большего выхода мече-
   ного продукта можно, повторив процедуру денатурация–отжиг–ферментативная ре-
   акция. Для этого после стадии 4 в вышеприведенной методике переходите к стадии 2.


Работа 15. Проведение гибридизации ДНК по Саузерну


   1. Исследуемую ДНК обработать соответствующими рестриктазами со-
      гласно рекомендациям производителя.
   2. Для денатурации фрагментов ДНК гель вымачивают в буфере для де-
      натурации (1,5М NaOH, 0,5М NaCI) при осторожном покачивании в
      течение 30 мин при комнатной температуре, затем выдерживают в
      буфере для нейтрализации (1,5М Трис-НСI, 0,5М NaCI, pH 6,5) в тече-
      ние 30 мин.



                                         46