Идентификация и исследование экспрессии генов. Епринцев А.Т - 47 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

ВГУ | Воронеж

Составители: 

Рубрика: 

47
3. За это время замочить нейлоновый или нитроцеллюлозный фильтр
для переноса ДНК в 6х SSPE в течение 5 мин.
4. Собрать систему для переноса ДНК, и провести перенос при комнат-
ной температуре в течение ночи. В качестве буфера для переноса ис-
пользуют 20х SSPE (1,5М Трис-НСI, 0,5 М NaCI, pH 6,5):
• сполоснуть H
2
O;
• инкубировать покачивая в 0.4N NaOH ~30 мин;
• в это время подготовить:
* 3 куска ватмана 3MM по размеру геля;
* 2 больших куска ватмана 3MM – на подложку;
* мембрану Hybond N
+
(размер геля + 3–5 mm c каждой стороны);
* 4 ленты парафилма или полиэтилена;
* стопку фильтровальной бумаги;
• поочередно обмакнуть в 0.4M NaOH большие куски ватмана и положить их
на подложку без пузырей, опустить концы в NaOH;
• положить гель дном вверх (без пузырей), налить сверху немного 0.4M NaOH;
• подложить рядом ленты парафилма (полиэтилена) так, чтобы мембрана не
соприкоснулась с ватманом 3MM, когда гель сожмется;
• мембрану смочить в 0.4M NaOH, положить на гель (без пузырей);
• сверху – 3 куска ватмана 3MM (нижний перед укладкой смочить в 0.4N
NaOH), стопку фильтровальной бумаги, плоскую пластину и груз (~300 г для
10 × 10 см
2
геля);
5. По окончании переноса снять фильтровальную бумагу и отметить
положение лунок на фильтре. Фильтр снять и для удаления прилип-
шей агарозы промыть в 20х SSPE в течение 1 мин.
6. Пришить ДНК к фильтру, поместив последний (стороной с ДНК
вверх) на 5 мин под УФ-лампу (254 нм).
7. Поместить фильтр в полиэтиленовый пакет и запаять его. Провести
предгибридизацию при 42
о
С в течение 10 мин и гибридизацию с соот-
ветствующим меченым зондом при той же температуре в течение
30–60 мин. 
3. За это время замочить нейлоновый или нитроцеллюлозный фильтр
  для переноса ДНК в 6х SSPE в течение 5 мин.
4. Собрать систему для переноса ДНК, и провести перенос при комнат-
  ной температуре в течение ночи. В качестве буфера для переноса ис-
  пользуют 20х SSPE (1,5М Трис-НСI, 0,5 М NaCI, pH 6,5):
     • сполоснуть H2O;
     • инкубировать покачивая в 0.4N NaOH ~30 мин;
     • в это время подготовить:
          * 3 куска ватмана 3MM по размеру геля;
          * 2 больших куска ватмана 3MM – на подложку;
          * мембрану Hybond N+ (размер геля + 3–5 mm c каждой стороны);
          * 4 ленты парафилма или полиэтилена;
          * стопку фильтровальной бумаги;
     • поочередно обмакнуть в 0.4M NaOH большие куски ватмана и положить их
     на подложку без пузырей, опустить концы в NaOH;
     • положить гель дном вверх (без пузырей), налить сверху немного 0.4M NaOH;
     • подложить рядом ленты парафилма (полиэтилена) так, чтобы мембрана не
     соприкоснулась с ватманом 3MM, когда гель сожмется;
     • мембрану смочить в 0.4M NaOH, положить на гель (без пузырей);
     • сверху – 3 куска ватмана 3MM (нижний перед укладкой смочить в 0.4N
     NaOH), стопку фильтровальной бумаги, плоскую пластину и груз (~300 г для
     10 × 10 см2 геля);
5. По окончании переноса снять фильтровальную бумагу и отметить
  положение лунок на фильтре. Фильтр снять и для удаления прилип-
  шей агарозы промыть в 20х SSPE в течение 1 мин.
6. Пришить ДНК к фильтру, поместив последний (стороной с ДНК
  вверх) на 5 мин под УФ-лампу (254 нм).
7. Поместить фильтр в полиэтиленовый пакет и запаять его. Провести
  предгибридизацию при 42 оС в течение 10 мин и гибридизацию с соот-
  ветствующим меченым зондом при той же температуре в течение
  30–60 мин.

                                    47

Страницы