Идентификация и исследование экспрессии генов. Епринцев А.Т - 49 стр.

   8. Инкубируйте мембрану в соответствующем объеме красящего рас-
      твора (0.1 мл (к 0.1 мл буфера (см. п. 7) добавить 0.7 мкл субстрата
      1 (НСТ) и 0.35 мкл субстрата 2 (5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфа-
      том)) на 1 см2 фильтра).
   9. Для прекращения реакции ополосните мембрану дистиллированной
      водой.


Комментарии к методике:
   1) Для экономии раствора инкубацию рекомендуется проводить в полиэтиленовом
      пакете, подобранному по размеру мембраны. Инкубацию проводите в темном
      месте, что уменьшает образование фона. Образование окраски может начаться
      через несколько минут, но обычно реакция занимает от 30 мин до 3 часов в за-
      висимости от количества меченой пробы (можно для ускорения образования ок-
      раски помещать мембрану на +37 °С, хотя это может приводить к усилению фона).
   2) Если получается сильно окрашенный фон на мембране, то можно уменьшить
      количество меченой ДНК пробы при гибридизации; увеличить объем буфера
      при предгибридизации, чтобы уменьшить вероятность подсыхания фильтра;
      можно использовать более сильное разведение коньюгата.



Работа 17. Дот-блот-гибридизация ПЦР-амплифицированной ДНК

   1. Исследуемую ДНК обработать соответствующими рестриктазами
      согласно рекомендациям производителя.
   2. Вымачить нейлоновый фильтр в дистиллированной воде не менее
      5 мин.
   3. 10–20 мкл ПЦР-амплифицированной ДНК добавить к 300 мкл рас-
      твора для денатурации (1,5М NaOH, 0,5 МNaCI). Денатурация при
      этом происходит практически мгновенно.




                                        49