Идентификация и исследование экспрессии генов. Епринцев А.Т - 51 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

ВГУ | Воронеж

Составители: 

Рубрика: 

51
глощают рекомбинантную плазмиду (так называемая трансформация).
Трансформированные клетки реплицируют плазмиду вместе с собствен-
ным геномом. Обычно используют плазмиды, придающие трансформиро-
ванной клетке устойчивость
(резистентность) к определенному антибио-
тику. При инкубации популяции клеток в присутствии антибиотика будут
реплицироваться только те клоны, которые содержат плазмиду. Из полу-
ченного клона выделяют плазмиду и после расщепления соответствующей
рестриктазой получают множество копий клонированного фрагмента ДНК.
Для выделения определенных фрагментов ДНК и последующего их
соединения с другими фрагментами для получения
новых комбинаций ге-
нов используются ферменты, которые специфически разрезают и вновь
сшивают молекулы ДНК. Наиболее важной группой ферментов являются
эндонуклеазы рестрикции
(рестриктазы), катализирующие специфиче-
ское расщепление двунитевой ДНК. Известно большое число рестриктаз.
Для их обозначения используются сокращенные названия микроорганиз-
мов – продуцентов (например,
EcoRI – эндонуклеаза, выделенная из
Escherichia coli). Этот фермент расщепляет ДНК по палиндромной после-
довательности,
т. е. короткому сегменту ДНК, в котором обе цепи при счи-
тывании в направлении 5'→3' имеют одинаковую последовательность.
Для
EcoRl это последовательность 5'-GAATTC-3'. Гомодимер EcoRI рас-
щепляет фосфодиэфирные связи обеих цепей между G и А. Это приводит к
образованию комплементарных «липких» концов (ААТТ), которые удер-
живаются вместе за счет спаривания оснований. Их, однако, можно легко
отделить друг от друга путем небольшого нагревания. При охлаждении
липкие концы гибридизуются вновь в правильной ориентации.
Кроме того, существуют рестриктазы, образующие
фрагменты с ту-
пыми концами (Sma I, EcoR V и др.).
Сшивка фрагментов ДНК производится тремя основными методами,
зависящими от того, какие концы имеют фрагменты сшиваемых ДНК. 
глощают рекомбинантную плазмиду (так называемая трансформация).
Трансформированные клетки реплицируют плазмиду вместе с собствен-
ным геномом. Обычно используют плазмиды, придающие трансформиро-
ванной клетке устойчивость (резистентность) к определенному антибио-
тику. При инкубации популяции клеток в присутствии антибиотика будут
реплицироваться только те клоны, которые содержат плазмиду. Из полу-
ченного клона выделяют плазмиду и после расщепления соответствующей
рестриктазой получают множество копий клонированного фрагмента ДНК.

     Для выделения определенных фрагментов ДНК и последующего их
соединения с другими фрагментами для получения новых комбинаций ге-
нов используются ферменты, которые специфически разрезают и вновь
сшивают молекулы ДНК. Наиболее важной группой ферментов являются
эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы), катализирующие специфиче-
ское расщепление двунитевой ДНК. Известно большое число рестриктаз.
Для их обозначения используются сокращенные названия микроорганиз-
мов – продуцентов (например, EcoRI – эндонуклеаза, выделенная из
Escherichia coli). Этот фермент расщепляет ДНК по палиндромной после-
довательности, т. е. короткому сегменту ДНК, в котором обе цепи при счи-
тывании в направлении 5'→3' имеют одинаковую последовательность.
Для EcoRl это последовательность 5'-GAATTC-3'. Гомодимер EcoRI рас-
щепляет фосфодиэфирные связи обеих цепей между G и А. Это приводит к
образованию комплементарных «липких» концов (ААТТ), которые удер-
живаются вместе за счет спаривания оснований. Их, однако, можно легко
отделить друг от друга путем небольшого нагревания. При охлаждении
липкие концы гибридизуются вновь в правильной ориентации.
     Кроме того, существуют рестриктазы, образующие фрагменты с ту-
пыми концами (Sma I, EcoR V и др.).
     Сшивка фрагментов ДНК производится тремя основными методами,
зависящими от того, какие концы имеют фрагменты сшиваемых ДНК.
                                   51

Страницы