Идентификация и исследование экспрессии генов. Епринцев А.Т - 50 стр.

  4. Каждый образец наносят на отдельный участок мембраны для полу-
     чения. При нанесении ДНК на мембрану необходимо учитывать, что
     для всасывания образца требуется около 1 мин.
  5. Пришить ДНК к фильтру, поместив последний (стороной с ДНК
     вверх) на 5 мин под УФ (254 нм).
  6. Промыть мембрану 20х SSPE (3М NaCI, 200мМ NaH2PO4xH2O, 20мМ
     ЭДТА) три раза по 5 мин.
  7. Гибридизовавшийся зонд выявляют соответствующими методами
     детекции.




     Глава V. Клонирование ДНК в бактериальные системы


     Для проведения экспериментов с фрагментами ДНК зачастую возни-
кает необходимость их многократно копирования (клонировать). В класси-
ческой методике клонирования ДНК используется способность клеток
бактерий поглощать и реплицировать короткие кольцевые молекулы ДНК,
известные как плазмиды. Сначала клонируемый фрагмент ДНК вырезается
из исходной ДНК с помощью рестриктазы. Обычно используются два раз-
ных фермента. В качестве переносчика («вектора») служит плазмида с
единственным участком, узнаваемым специфической рестриктазой. Коль-
цевая плазмида линеаризуется с помощью рестрикции и затем смешивает-
ся с изучаемым фрагментом ДНК. Поскольку фрагмент и вектор имеют
одинаковые липкие концы, некоторые из молекул будут гибридизоваться
таким образом, что клонируемый фрагмент окажется интегрированным в
структуру вектора. Затем концы линейной молекулы ковалентно сшивают-
ся с помощью ДНК-лигазы с образовании новой «рекомбинантной» плаз-
миды. При обработке большого количества клеток некоторые из них по-

                                  50