Идентификация и исследование экспрессии генов. Епринцев А.Т - 48 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

ВГУ | Воронеж

Составители: 

Рубрика: 

48
8. Промыть фильтр в двух-трех сменах 2х SSPE, 0,1% ДСН, по 5 мин в
каждой смене.
9. Гибридизовавшийся зонд выявляют соответствующими методами де-
текции.
Комментарии к методике:
1) Считается, что присутствие Mg
2+
ингибирует связывание ДНК с мембраной (даже
при ~1мМ Mg
2+
). Добавление ЭДТА до 100мМ перед денатурацией восстанавливает
связывающую способность даже для 6мМ MgCl
2
.
Работа 16. Выявление меченых ДНК с образованием нерастворимого
окрашенного продукта
1. После переноса ДНК на мембрану гель сполоснуть в 2х SSC буфере
при комнатной температуре. Промокнуть излишек жидкости.
2. Проинкубируйте мембрану в течение 30 мин в блокирующем буфере
(0.1 мл на 1 см2 фильтра). Буфер: 5% БСА, 0.1% Tween 20, 150мМ
NaCI в 50мМ фосфатном буфере.
3. Промойте мембрану в 2х SSC буфере.
4.
Разведите коньюгат стрептавидин-щелочная фосфатаза в буфере
(
0.1% Tween 20 в 50мМ фосфатном буфере) до разведения 1 : 3000
(0.1 мл на 1 см
2
фильтра). Разведенный коньюгат стабилен при +4 °С
около 12 часов.
5.
Проинкубируйте мембрану в течение 30 мин в соответствующем
объеме разведенного коньюгата.
6.
Удалите несвязавшийся коньюгат, промывая мембрану 2 раза по
15 мин 2х SSC буфером.
7.
Проинкубируйте мембрану с буфером (0,1М Трис-HCI рН 7.6, 10мМ
MgCI
2
, 10мМ ZnCI
2
, 0.1% Тритон Х-100) в течение 2 мин. 
   8. Промыть фильтр в двух-трех сменах 2х SSPE, 0,1% ДСН, по 5 мин в
      каждой смене.
   9. Гибридизовавшийся зонд выявляют соответствующими методами де-
      текции.


Комментарии к методике:
1) Считается, что присутствие Mg2+ ингибирует связывание ДНК с мембраной (даже
   при ~1мМ Mg2+). Добавление ЭДТА до 100мМ перед денатурацией восстанавливает
   связывающую способность даже для 6мМ MgCl2.


Работа 16. Выявление меченых ДНК с образованием нерастворимого
окрашенного продукта


   1. После переноса ДНК на мембрану гель сполоснуть в 2х SSC буфере
      при комнатной температуре. Промокнуть излишек жидкости.
   2. Проинкубируйте мембрану в течение 30 мин в блокирующем буфере
      (0.1 мл на 1 см2 фильтра). Буфер: 5% БСА, 0.1% Tween 20, 150мМ
      NaCI в 50мМ фосфатном буфере.
   3. Промойте мембрану в 2х SSC буфере.
   4. Разведите коньюгат стрептавидин-щелочная фосфатаза в буфере
      (0.1% Tween 20 в 50мМ фосфатном буфере) до разведения 1 : 3000
      (0.1 мл на 1 см2 фильтра). Разведенный коньюгат стабилен при +4 °С
      около 12 часов.
   5. Проинкубируйте мембрану в течение 30 мин в соответствующем
      объеме разведенного коньюгата.
   6. Удалите несвязавшийся коньюгат, промывая мембрану 2 раза по
      15 мин 2х SSC буфером.
   7. Проинкубируйте мембрану с буфером (0,1М Трис-HCI рН 7.6, 10мМ
      MgCI2, 10мМ ZnCI2, 0.1% Тритон Х-100) в течение 2 мин.


                                     48

Страницы