Основы клинической иммунологии и методологические подходы к оценке иммунного статуса. Гончаров А.Г - 47 стр.

                        Материалы и оборудование
   1. Исследуемая суспензия лимфоцитов.
   2. Забуференный изотонический раствор хлорида натрия.
   3. 0,01% раствор поли-L-лизина (мол.масса 40000-80000) в забуференном
изотоническом растворе хлорида натрия.
   4. 0.0004% раствор этидиума бромида
   5. Моноклональные антитела OKТ3+, OKТ4+, OKТ8+ или их аналоги, выпус-
каемые Институтом иммунологии Минздрава РФ, Нижегородским НИИВС
Минздрава РФ и другими организациями.
   6. Свиные антимышиные антитела, меченные ФИТЦ.
   7. Глицерин.
   8. Люминесцентный микроскоп.
   9. Предметные и покровные стекла.
   10. Бытовой холодильник.
   11. Лабораторная посуда.
   12. Центрифуга с бакет-ротором.

                              Описание метода
    1. Приготовление забуференного изотонического раствора хлорида натрия
(ЗФР): 15,6 г NaН2РО растворить в дистиллированной воде, доведя объем до 1
литра (раствор № 1); 35,8 г Nа2НРО растворить в дистиллированной воде, доведя
объем до 1 литра (раствор № 2). Смешать 13 частей раствора № 1 и 37 частей
раствора № 2, в полученной смеси растворить 8,5 г NаС1; рН раствора должен
составить 7,2-7,4.
    2. Проведение реакции. Выделенные на градиенте плотности лимфоциты
дважды отмывают охлажденным до 4°С ЗФР в течение 10 мин при 1000-1500
об/мин; суспензию лимфоцитов разводят ЗФР до концентрации 2×10 клеток в 1
мл.
    Тщательно отмытые и обезжиренные предметные стекла покрывают 0.01%
раствором поли-L-лизина в ЗФР путем нанесения его на стекло с последующей
инкубацией в течение 1 часа при 37°С (при отсутствии поли-L-лизина можно
воспользоваться также 0,4% раствором формвара в дихлорэтане, при этом стек-
ло однократно опускают в раствор на 5-10 с; следует помнить, что раствор ток-
сичен и работа с ним требует определенных мер предосторожности - все мани-
пуляции необходимо проводить в вытяжном шкафу). На стекло, покрытое слоем
поли-L-лизина или формвара, наносят 0,05 мл суспензии лимфоцитов (для опре-
деления Т-лимфоцитов и их субпопуляций делают три мазка для подсчета
Т-лимфоцитов (CD3+), Т-хелперов (CD4+) и Т-супрессоров (CD8+), мазки можно
сделать на трех стеклах или на участках одного стекла, в последнем случае маз-
ки следует пометить с помощью воскового карандаша на обратной стороне стек-
ла. Клетки осаждают на стекле во влажной камере при температуре 37°С (в ка-
честве влажной камеры используют чашку Петри с вложенной в нее влажной
фильтровальной бумагой). После осаждения клеток препарат осторожно промы-

                                                                           45