Основы клинической иммунологии и методологические подходы к оценке иммунного статуса. Гончаров А.Г - 60 стр.

               Инкубация клеток с индикаторным вирусом

    После 24 часов инкубации из микропланшетов вытряхивают ПС с раститро-
ванными пробами и в каждую лунку вносится по 100 мкл ПС, содержащей 100
цитопатических доз (ЦПД) индикаторного вируса - вируса везикулярного стома-
тита (ВВС) штамм Индиана. Необходимый для проведения анализа ВВС накап-
ливается заражением монослойной культуры L-41, отбором и лиофилизацией
культуральной жидкости после достижения 70-80% полной деструкции моно-
слоя клеток; инфекционность вируса определяется предварительным титровани-
ем вирусосодержащей жидкости в условиях, аналогичных проведению анализа
определения ИФН статуса.
    После внесения ВВС в опытные микропланшеты последние помещаются в
СО-термостат при 37°С на 18-24 часа.
    Остановка инкубации производится при достижении 100% деструкции мо-
нослоя клеток в лунках с контролем ВВС и при значительной деструкции моно-
слоя в лунках, содержавших наибольшие разведения референса ИФН и иссле-
дуемых проб. Оптимальным считается момент остановки инкубации в то время,
когда достигнута 90-100%-ная деструкция монослоя в лунках, содержавших 0,78
МЕ/мл референса ИФН и соотв. 20-30%-ная деструкция монослоя в лунках, со-
державших 1,56 МЕ/мл референса ИФН. При соблюдении этих условий достига-
ется максимальная чувствительность методики, позволяющая определять содер-
жание ИФН в пробах с точностью до +1 МЕ/мл.

                        Учет результатов анализа
    После остановки инкубации клеточного монослоя с ВВС из планшетов вы-
тряхивается вирусосодержащая жидкость и в каждую лунку 8-канальной микро-
пипеткой вносится 50 мкл раствора красителя кристаллического фиолетового
(0,5% раствор на 30% этаноле). Окрашивание производится в течение 10 мин
при комнатной температуре. После этого из микропланшетов вытряхивается
раствор красителя и микропланшеты промываются в проточной водопроводной
воде комнатной температуры погружением 5-10 раз. Затем микропланшеты вы-
сушиваются на воздухе.
    Учет результатов можно производить визуально, определяя степень дест-
рукции монослоя клеток в каждой лунке по степени окрашивания дна лунок.
При этом в качестве калибровочной кривой используются столбцы микроплан-
шета, в которых был раститрован референс-препарат ИФН. Сравнивая плотность
клеточного монослоя в лунках с референсом ИФН и в опытных лунках находит-
ся какая-либо лунка в столбцах с референсом ИФН, которая соответствовала бы
по плотности монослоя рассматриваемой опытной лунке. Таким образом, зная
концентрации референса ИФН в каждой из лунок и разведение опытной пробы,
определяется истинная концентрация ИФН в анализируемой пробе.
    Более точный учет результатов производится с помощью точного определе-
ния абсорбированного клетками монослоя красителя. Это достигается путем до-

58