Основы клинической иммунологии и методологические подходы к оценке иммунного статуса. Гончаров А.Г - 62 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

БФУ им. Канта | Калининград

Составители: 

Рубрика: 

60
15. Фильтры “Владипор” с диаметром пор 0,22 и 0,45 мкм.
16. Микропипетки с регулируемым объемом.
17. СО
2
-инкубатор.
18. Ламинарный бокс.
19. Харвестер для переноса клеток на фильтры (Дайнатек, Швейцария или
собственного изготовления).
20. Стекловолокнистые фильтры (Ватман, США).
21. Центрифуга с охлаждением.
22. Сцинтилляционный счетчик.
23. Трихлоруксусная кислота, толуол, РРО, РОРОР, этанол.
Описание метода
Приготовление сред. При получении ИЛ-2 используют две основные сре-
ды:
Среда №1 (для отмывки клеток) -
среда 199, обогащенная 10% (по объему)
эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС), 10 мМ HEPES, 50 мкг/мл гентами-
цина.
Среда №2 (для культивирования клеток) - среда RPMI 1640, с 2 мМ L-глюта-
мина, 25 мМ HEPES, 50 мкг/мл гентамицина, 6×10 М 2-меркаптоэтанола, 1-5%
ЭТС, инактивированной при 56°С в течение 30 мин.
Для длительного хранения клеток в жидком азоте используют следующие
среды:
Среда №3 (для
замораживания клеток) - среда RPMI 1640, 20% ЭТС, 10%
диметилсульфоксида (ДМСО).
Среда №4 (для размораживания клеток) - среда 199, 50 мкг/мл гентамицина,
10 мМ HEPES.
Приготовление клеточных суспензий
В качестве стандартного препарата ИЛ-2 используют супернатант мышиных
или крысиных селезеночных клеток, стимулированных КонА. Суспензию клеток
селезенки получают в стеклянном гомогенизаторе или любым другим доступ-
ным способом, фильтруют через стальную или капроновую сеточку с отвер-
стиями диаметром около 100 мкм, затем 3 раза отмывают в среде N1 8-10 мин
при 400 g.
Следует
отметить, что ИЛ-2, полученный от крысы или мыши, не действует
на лимфоциты человека, в то время как человеческий ИЛ-2 активирует не только
Т-клетки человека, но и лимфоциты лабораторных животных. Для получения
человеческого ИЛ-2 используют лейкоциты периферической крови, полученные
путем градиентного центрифугирования в растворе фикол-пак или любым дру-
гим способом
. Источником человеческого ИЛ-2 могут служить также некоторые
перевиваемые клеточные линии (например: Jurkat-FHCRC). 
   15. Фильтры “Владипор” с диаметром пор 0,22 и 0,45 мкм.
   16. Микропипетки с регулируемым объемом.
   17. СО2-инкубатор.
   18. Ламинарный бокс.
   19. Харвестер для переноса клеток на фильтры (Дайнатек, Швейцария или
собственного изготовления).
   20. Стекловолокнистые фильтры (Ватман, США).
   21. Центрифуга с охлаждением.
   22. Сцинтилляционный счетчик.
   23. Трихлоруксусная кислота, толуол, РРО, РОРОР, этанол.

                             Описание метода
      Приготовление сред. При получении ИЛ-2 используют две основные сре-
ды:
    Среда №1 (для отмывки клеток) - среда 199, обогащенная 10% (по объему)
эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС), 10 мМ HEPES, 50 мкг/мл гентами-
цина.
    Среда №2 (для культивирования клеток) - среда RPMI 1640, с 2 мМ L-глюта-
мина, 25 мМ HEPES, 50 мкг/мл гентамицина, 6×10 М 2-меркаптоэтанола, 1-5%
ЭТС, инактивированной при 56°С в течение 30 мин.
    Для длительного хранения клеток в жидком азоте используют следующие
среды:
    Среда №3 (для замораживания клеток) - среда RPMI 1640, 20% ЭТС, 10%
диметилсульфоксида (ДМСО).
    Среда №4 (для размораживания клеток) - среда 199, 50 мкг/мл гентамицина,
10 мМ HEPES.

                    Приготовление клеточных суспензий

    В качестве стандартного препарата ИЛ-2 используют супернатант мышиных
или крысиных селезеночных клеток, стимулированных КонА. Суспензию клеток
селезенки получают в стеклянном гомогенизаторе или любым другим доступ-
ным способом, фильтруют через стальную или капроновую сеточку с отвер-
стиями диаметром около 100 мкм, затем 3 раза отмывают в среде N1 8-10 мин
при 400 g.
    Следует отметить, что ИЛ-2, полученный от крысы или мыши, не действует
на лимфоциты человека, в то время как человеческий ИЛ-2 активирует не только
Т-клетки человека, но и лимфоциты лабораторных животных. Для получения
человеческого ИЛ-2 используют лейкоциты периферической крови, полученные
путем градиентного центрифугирования в растворе фикол-пак или любым дру-
гим способом. Источником человеческого ИЛ-2 могут служить также некоторые
перевиваемые клеточные линии (например: Jurkat-FHCRC).


60

Страницы