Основы клинической иммунологии и методологические подходы к оценке иммунного статуса. Гончаров А.Г - 63 стр.

    Для получения мышиного ИЛ-2 в безмитогенной системе служит одна из
сублиний лимфомы EI-4. Клетки EI-4 пассируют на мышах С57ВI/6, вводя им
внутрибрюшинно по 10 клеток в 1 мл среды 199. Через 8-10 суток у животных
забирают асцитную жидкость и 3 раза промывают клетки, содержащиеся в ней, в
среде №1.
    Культуру EI-4 можно поддерживать in vitro в пластиковых матрасах. Кле-
точную суспензию (0,3-0,5 млн в мл) инкубируют в среде №2 с 5% ЭТС при
37°С и 5% СО в течение 48-72 часов. Затем клетки снимают со дна матраса па-
лочкой с наконечником из силиконовой резины, сделанным, например, из проб-
ки от пенициллинового флакона.
    Часть клеток EI-4 идет на получение ИЛ-2, а избыток можно хранить в жид-
ком азоте. С этой целью клетки разводят в среде №3 до концентрации 40-50
млн/мл и помещают на 2-4 часа в морозильник с температурой -20°С. Затем
клетки переносят в морозильник с температурой -70°С и только после этого - в
жидкий азот.
    Размораживают клеточную суспензию в водяной бане при 37°С. После раз-
мораживания клетки разводят средой №4 так, чтобы конечная концентрация
ДМСО в среде не превышала 1%, и промывают 3 раза в среде №4.
    В суспензии, приготовленной любым из перечисленных способов, опреде-
ляют с помощью окраски трипановым синим процент жизнеспособных клеток и
приступают к их культивированию для получения ИЛ-2.


                             Продукция ИЛ-2

    Клетки EI-4 в концентрации 1 млн/мл ресуспендируют в среде №2 и культи-
вируют в пластиковых матрасах в присутствии 10 мг/мл РМА. (Концентрация
ЭТС в среде не должна превышать 1%). Спленоциты в концентрации 10 млн/мл
культивируют в среде №2 с 5% ЭТС в присутствии 2,0 мкг/мл КонА.
    После 40-часового культивирования при 37°С в атмосфере с 5% СО из мат-
расов собирают культуральную жидкость, центрифугируют ее 8-10 мин при
400g и диализуют против 0.05М “трис”-HCL буфера для удаления ингибирую-
щих субстанций и низкомолекулярных веществ. Диализ проводят в течение 48
часов на магнитной мешалке при 4-10°С с однократной сменой буфера. После
диализа супернатанты обогащают пятикратной средой RPMI 1640 для восста-
новления изотоничности (1 объем среды к 4 объемам супернатанта) и фильтру-
ют через фильтры с диаметром пор 0,22 мкм. Супернатанты хранят при -20°С до
использования.
    Очистка супернатанта, содержащего ИЛ-2, проводится в несколько этапов.
Вначале препарат подвергают высаливанию сульфатом аммония при 80% насы-
щении на холоду, после чего преципитат диализируют против 0,05М “трис”-
HCL буфера. Полученный материал фракционируют на колонках с сефадексом
С-100, уравновешенным 0,22-0,24% бикарбонатом натрия. Мышиный ИЛ-2

                                                                          61