Основы клинической иммунологии и методологические подходы к оценке иммунного статуса. Гончаров А.Г - 64 стр.

элюируется во фракции с молекулярной массой 30 кД. После колонки каждую
пробу обогащают 10-кратной средой RPMI-1640 (1 объем среды добавляют к 9
объемам фракции) и эмбриональной телячьей сыворотки (до 1%, так как в бес-
сывороточной среде ИЛ-2 плохо сохраняется). Каждую пробу фильтруют через
фильтры с диаметром пор 0,22 мкм и тестируют на биологическую активность.
Концентрирование белка после колонки проводят с применением фильтров
Amikon UM-2 или UM-10.
   Дальнейшую очистку ИЛ-2 можно производить с помощью ионообменной
хроматографии на ДЕАЕ-сефацеле, изоэлектрофокусированием и электрофоре-
зом в SOS-полиакриламидном геле.
              Тестирование биологической активности ИЛ-2

     Тестирование биологической активности ИЛ-2 и супернатантов, содержащих
его, основано на использовании ИЛ-2-зависимых Т-клеточных линий и клонов.
Однако такие клоны довольно трудно получить и поддерживать. Другой способ
тестирования основан на способности ИЛ-2 поддерживать рост Т-кл., активиро-
ванных митогеном.
     Для получения активированных клеток (КонА-бластов) спленоциты мышей в
концентрации 5 млн/мл (в среде №2 с 5% ЭТС) стимулируют 2,0 мкг/мл КонА в
течение 72 часов при 37°С и 5% СО2. Стимуляцию можно осуществлять в пла-
стиковых матрасах. После окончания культивирования клетки промывают 3 раза
средой №1 и разводят в среде №2 с 5% ЭТС до концентрации 8×10 /мл. Следует
помнить, что вместе с клетками может остаться небольшое количество КонА,
способного вызывать такое же действие, как ИЛ-2. Блокирование активности
КонА достигается добавлением в среду 0,1М метил-а-D-маннопиранозида.
     Тестирование активности ИЛ-2 производят в планшетах для иммунологиче-
ских реакций. Вначале получают несколько серийных двукратных разведений
ИЛ-2 в среде №2 (обычно берут по 4 лунки на каждое разведение). Напри-
мер,при разведении ИЛ-2 от 1:2 до 1:1024 в 1 и 2 лунки одного ряда планшета
вносят по 100 мкл супернатанта, а в 3-10 - по 50 мкл среды №2. Затем из второй
лунки забирают 50 мкл, переносят в следующую, 3-ю лунку, перемешивают и
т.д. Аналогичные разведения получают еще в 3 рядах планшета.
     После разведения ИЛ-2 в каждую лунку добавляют по 50 мкл 0.4М раствора
метил-а-D-маннопиранозида в среде №2, 50 мкл отмытых КонА-бластов, разве-
денных до концентрации 8×10 /мл. Общий объем в лунке доводят до 0,2 мл сре-
дой №2. В качестве контроля вместо супернатанта также вносят среду №2.
Клетки культивируют в течение 24 часов при 37°С в атмосфере с 5% СО. Про-
лиферацию в культуре оценивают по включению “Н-тимидина: за 4-5 часов до
окончания культивирования в каждую лунку вносят по 2 мкКи изотопа с моляр-
ной активностью 1 Ки/мМ в общем объеме 10 мкл.
     После окончания культивирования клетки переносят с помощью харвестера
или пипетки на фильтры (стекловолокнистые СГ/с для харвестера или фильтры
“Владипор” при использовании установки для вакуумного фильтрования). Оса-
жденные клетки промывают средой 199 (примерно 10 мл на каждую лунку),

62