Очистка ферментов и методы исследования их каталитических свойств. Климова А.Т. - 11 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

ВГУ | Воронеж

Составители: 

Рубрика: 

11
последней порции соли раствор перемешивать еще 15–30 мин, а затем цен-
трифугировать при 4 тыс.–10 тыс. g в течение 20–30 мин. На следующей
стадии использовать полученный супернатант.
II стадия: 80 % (NH
4
)
2
SO
4
(см. приложение 1);
29.5 г – 100 мл исходного раствора;
у г – 4 мл супернатанта.
Взвесить 1.1 г (NH
4
)
2
SO
4
и повторить процедуру, как на стадии 1.
После центрифугирования осадок перерастворить в небольшом объеме
50 мМ трис-НCl буфера (рН 7.5) и измерить в нем спектрофотометрически
активность МДГ. Далее освобождают фермент от избытка сульфата аммо-
ния путем обессоливания.
Работа 4. Обессоливание с помощью сефадекса G-25
Белки чаще всего разделяют методом хроматографии на колонках (ко-
лоночная хроматография). В этом случае смесь молекул в растворе про-
пускают через колонку, содержащую твердый пористый матрикс. В ре-
зультате взаимодействия с матриксом различные белки проходят через ко-
лонку с различной скоростью. После того как разные белки достигнут в
определенной последовательности
дна колонки, их собирают отдельными
фракциями. В настоящее время разработано и применяется множество
матриксов различных типов, используя которые можно делить белки со-
гласно их заряду (ионообменная хроматография), размеру (хроматография
гель-фильтрацией), или способности связываться с различными химиче-
скими группами (аффинная хроматография).
Низкомолекулярные соединения удаляют с помощью гель-фильтрации
через сефадекс G-25. Сефадекс
– гель, состоящий из полисахаридных це-
почек декстрана, сшитых поперечными связями. Цифра сефадекса харак-
теризует пористость. Так, G-10, G-15, G-25 мелкопористые (с небольшим
размером пор, т. е. с большим количеством поперечных связей); G-150,
G-200 – крупнопористые (с малым количеством поперечных связей).
Оборудование и реактивы.
Приготовление обессоливающей колонки: около 3 г сухого сефадек-
са G-25 суспендировать в 50 мМ трис-НСl буфере, рН 7.5, где он должен
предварительно набухать в течение 3 часов, либо прокипятить на водяной
бане в течение 1 ч. Далее заполнить суспензией колонку, и промывать бу-
последней порции соли раствор перемешивать еще 15–30 мин, а затем цен-
трифугировать при 4 тыс.–10 тыс. g в течение 20–30 мин. На следующей
стадии использовать полученный супернатант.
     II стадия: 80 % (NH4)2SO4 (см. приложение 1);
     29.5 г – 100 мл исходного раствора;
     у г – 4 мл супернатанта.
     Взвесить 1.1 г (NH4)2SO4 и повторить процедуру, как на стадии 1.
После центрифугирования осадок перерастворить в небольшом объеме
50 мМ трис-НCl буфера (рН 7.5) и измерить в нем спектрофотометрически
активность МДГ. Далее освобождают фермент от избытка сульфата аммо-
ния путем обессоливания.

           Работа 4. Обессоливание с помощью сефадекса G-25

    Белки чаще всего разделяют методом хроматографии на колонках (ко-
лоночная хроматография). В этом случае смесь молекул в растворе про-
пускают через колонку, содержащую твердый пористый матрикс. В ре-
зультате взаимодействия с матриксом различные белки проходят через ко-
лонку с различной скоростью. После того как разные белки достигнут в
определенной последовательности дна колонки, их собирают отдельными
фракциями. В настоящее время разработано и применяется множество
матриксов различных типов, используя которые можно делить белки со-
гласно их заряду (ионообменная хроматография), размеру (хроматография
гель-фильтрацией), или способности связываться с различными химиче-
скими группами (аффинная хроматография).
    Низкомолекулярные соединения удаляют с помощью гель-фильтрации
через сефадекс G-25. Сефадекс – гель, состоящий из полисахаридных це-
почек декстрана, сшитых поперечными связями. Цифра сефадекса харак-
теризует пористость. Так, G-10, G-15, G-25 мелкопористые (с небольшим
размером пор, т. е. с большим количеством поперечных связей); G-150,
G-200 – крупнопористые (с малым количеством поперечных связей).
      Оборудование и реактивы.
      Приготовление обессоливающей колонки: около 3 г сухого сефадек-
са G-25 суспендировать в 50 мМ трис-НСl буфере, рН 7.5, где он должен
предварительно набухать в течение 3 часов, либо прокипятить на водяной
бане в течение 1 ч. Далее заполнить суспензией колонку, и промывать бу-
                                  11

Страницы