Очистка ферментов и методы исследования их каталитических свойств. Климова А.Т. - 13 стр.

     При взаимодействии белков с ионообменниками в ходе адсорбции об-
разуются множественные электростатические связи между функциональ-
ными группами на поверхности адсорбционной матрицы и группами бел-
ковых молекул, несущими противоположный заряд. Прочность связывания
каждого белка на матрице зависит от ряда факторов и, в первую очередь,
от величины заряда белка, зависящей от рН и ионной силы раствора. При
пропускании через колонку определенного элюирующего раствора проис-
ходит хроматографическое разделение белков в зависимости от степени их
взаимодействия с ионообменником. Разрыв связей достигается путем из-
менения рН или ионной силы протекающего раствора.
     Оборудование и реактивы.
     Хроматографическая колонка с рабочим объемом 20–30 мл, причем
соотношение длины и диаметра колонки может варьировать от 20 до 4,
магнитная мешалка, коллектор фракций, центрифуга, химическая посуда,
ДЭАЭ-целлюлоза, 50 мМ трис-HCl буфер, рН 7.5.
     Приготовление ионообменной колонки (иониты промышленного изго-
товления после набухания фракционируют по размеру частиц и подверга-
ют «циклизации» – переводу их из одной формы в другую): около 6 г цел-
люлозы суспендировать в 50-кратном объеме дистиллированной воды, пе-
ремешать и оставить набухать на ночь. Слой жидкости над ионообменни-
ком декантировать, снова залить дистиллированной водой, перемешать и
через 2–2.5 ч верхний слой жидкости декантировать вместе с неосевшими
мелкими частицами. К оставшемуся осадку прилить 15-кратный объем
0.5 М HCl и через 15–30 мин (время обработки анионообменника кислотой
не должно быть большим) отмыть водой до рН 5.0. На следующем этапе
сорбент обработкой 15-кратным объемом 0.5 М NaOH в течение 30 мин
переводят в ОН- форму. Затем осадок на 5 мин заливают свежей порцией
щелочи, фильтруют через колонку Бюхнера и отмывают дистиллирован-
ной водой до рН 7.0. После этого ионит уравновешивают 15-кратным объ-
емом 50 мМ трис-HCl буфером, рН 7.5 и оставляют его на ночь, после чего
заполняют колонку, следя за значением рН. В процессе подобной обработ-
ки стабилизируется структура ионита и функциональные группы становят-
ся более доступными. Одновременно ионит освобождается от примесей.
     Ход работы.
     Раствор фермента после стадии очистки через сефадекс G-25 нанести
на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой (объем раствора белка может значительно
                                  13