Очистка ферментов и методы исследования их каталитических свойств. Климова А.Т. - 14 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

ВГУ | Воронеж

Составители: 

Рубрика: 

14
варьировать, но его концентрация не должна превышать 5 мг/мл). Колонку
промывают буфером для удаления не сорбируемых в данных условиях
белков до тех пор, пока в элюате не останется белка. Затем начинают элю-
цию белка с колонки раствором KCl с линейным градиентом концентрации
(0–0.5М) в 50 мМ трис-HCl буфере, рН 7.5. В смеситель вносят 150
мл бу-
фера, а в питающий сосуд – 150 мл 0.5 М KCl в буфере. Скорость элюции
1–1.5 мл/мин, время разделения около 4 часов. Элюат собирают фракция-
ми по 2 мл и измеряют в них активность фермента.
По окончании фракционирования анионообменник необходимо реге-
нерировать. Для этого к использованному сорбенту добавляют 30-кратный
объем 0.2–0.5 н. раствора NaOH, перемешивают до
получения однородной
суспензии и фильтруют на воронке Бюхнера. Обработку щелочью прово-
дят дважды. После этого ионит отмыть водой до нейтральной реакции
фильтрата. Регенерированный анионообменник уравновесить буферным
раствором. Хранить в солевой форме, добавляя антисептики: 0.02%-й азид
натрия, мертиолоат или хлороформ.
Работа 6. Определение молекулярной массы нативного фермента
с применением гель-хроматографического метода
Гель-хроматография – метод разделения веществ на основе их моле-
кулярной массы. Принцип метода основан на том, что для большого числа
глобулярных белков имеется линейная зависимость между логарифмом
молекулярной массы и объемом элюирования с колонки, заполненной ге-
лем с определенной величиной пор. Поэтому для определения молекуляр-
ной массы глобулярного белка достаточно
определить объем его элюции с
предварительно откалиброванной колонки. Калибровку колонки проводят,
пропуская через нее белки с известной молекулярной массой и определяя
объем элюции для каждого из них.
Массу исследуемого белка также можно рассчитать по формулам:
lg Mr = 6,0404 – 0,8032(Ve/Vсв) для сефадекса G-150,
lg Mr = 6,698 – 0,987(Ve/Vсв) для сефадекса G-200, где
V
св
– свободный объем колонки, определяемый эмпирически с помо-
щью голубого декстрана; 
варьировать, но его концентрация не должна превышать 5 мг/мл). Колонку
промывают буфером для удаления не сорбируемых в данных условиях
белков до тех пор, пока в элюате не останется белка. Затем начинают элю-
цию белка с колонки раствором KCl с линейным градиентом концентрации
(0–0.5М) в 50 мМ трис-HCl буфере, рН 7.5. В смеситель вносят 150 мл бу-
фера, а в питающий сосуд – 150 мл 0.5 М KCl в буфере. Скорость элюции
1–1.5 мл/мин, время разделения около 4 часов. Элюат собирают фракция-
ми по 2 мл и измеряют в них активность фермента.
    По окончании фракционирования анионообменник необходимо реге-
нерировать. Для этого к использованному сорбенту добавляют 30-кратный
объем 0.2–0.5 н. раствора NaOH, перемешивают до получения однородной
суспензии и фильтруют на воронке Бюхнера. Обработку щелочью прово-
дят дважды. После этого ионит отмыть водой до нейтральной реакции
фильтрата. Регенерированный анионообменник уравновесить буферным
раствором. Хранить в солевой форме, добавляя антисептики: 0.02%-й азид
натрия, мертиолоат или хлороформ.

     Работа 6. Определение молекулярной массы нативного фермента
          с применением гель-хроматографического метода

    Гель-хроматография – метод разделения веществ на основе их моле-
кулярной массы. Принцип метода основан на том, что для большого числа
глобулярных белков имеется линейная зависимость между логарифмом
молекулярной массы и объемом элюирования с колонки, заполненной ге-
лем с определенной величиной пор. Поэтому для определения молекуляр-
ной массы глобулярного белка достаточно определить объем его элюции с
предварительно откалиброванной колонки. Калибровку колонки проводят,
пропуская через нее белки с известной молекулярной массой и определяя
объем элюции для каждого из них.
      Массу исследуемого белка также можно рассчитать по формулам:

            lg Mr = 6,0404 – 0,8032(Ve/Vсв) для сефадекса G-150,
          lg Mr = 6,698 – 0,987(Ve/Vсв) для сефадекса G-200, где

   Vсв – свободный объем колонки, определяемый эмпирически с помо-
щью голубого декстрана;
                                   14

Страницы