Очистка ферментов и методы исследования их каталитических свойств. Климова А.Т. - 16 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

ВГУ | Воронеж

Составители: 

Рубрика: 

16
около 2 млн, несущий ковалентно присоединенные хромофорные группы) в
соответствующем буфере. Наиболее яркую фракцию определяют либо визу-
ально, либо спектрофотометрически при 630 нм.
После определения свободного объема через колонку последовательно
пропускают растворы соответствующих белков-маркеров (по 3–4 мг в объ-
еме 0.5–1 мл). Белки удобно наносить последовательно в порядке умень-
шения их молекулярной массы с
интервалом, зависящим от размера ко-
лонки. Во время нанесения белков колонку перекрыть. Элюат, вытекаю-
щий из колонки со скоростью 15–20 мл/ч, собирают небольшими порция-
ми (1–2 мл). Содержание белка во фракциях определяют спектрофотомет-
рически при 280 нм. Оптическую плотность растворов, содержащих рибо-
нуклеазу, определяют при 230 нм, цитохром
с – при 412 нм. Строят про-
филь элюции отдельных белковых фракций. Для этого вычерчивают гра-
фик, на горизонтальной оси которого откладывают номера фракций или
объем прошедшей через колонку жидкости, а на вертикальной оси – вели-
чины оптической плотности фракций. Затем строят график зависимости
между логарифмом молекулярной массы белков-маркеров и объемом
элюирования с
колонки. После построения калибровочного графика на ко-
лонку наносят исследуемый белок и, определив объем элюции, находят по
графику его молекулярную массу.
Хранить сефадекс можно в набухшем состоянии (в холодильнике), доба-
вив к нему 0.02%-й азид натрия. Для перевода сефадекса в первоначальное со-
стояние его перемешивают несколько минут с 2-кратным объемом 50%-го
этанола и фильтруют на воронке Бюхнера. Затем перемешивают 30 мин с
2-кратным объемом неразведенного этанола и опять фильтруют. Обработку
неразведенным спиртом
повторяют несколько раз. Осадок высушивают в тер-
мостате при 60–80 °С.
ТЕМА 2. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ БЕЛКОВ
Электрофорез занимает центральное место среди методов исследова-
ния белков и нуклеиновых кислот. В современной научной литературе
редко можно встретить статью, в которой бы на той или иной стадии
фракционирования или характеристики этих биополимеров не был исполь-
зован электрофорез. Метод позволяет разделять макромолекулы, разли-
чающиеся по таким важнейшим параметрам, как размеры (или
молеку-
около 2 млн, несущий ковалентно присоединенные хромофорные группы) в
соответствующем буфере. Наиболее яркую фракцию определяют либо визу-
ально, либо спектрофотометрически при 630 нм.
     После определения свободного объема через колонку последовательно
пропускают растворы соответствующих белков-маркеров (по 3–4 мг в объ-
еме 0.5–1 мл). Белки удобно наносить последовательно в порядке умень-
шения их молекулярной массы с интервалом, зависящим от размера ко-
лонки. Во время нанесения белков колонку перекрыть. Элюат, вытекаю-
щий из колонки со скоростью 15–20 мл/ч, собирают небольшими порция-
ми (1–2 мл). Содержание белка во фракциях определяют спектрофотомет-
рически при 280 нм. Оптическую плотность растворов, содержащих рибо-
нуклеазу, определяют при 230 нм, цитохром с – при 412 нм. Строят про-
филь элюции отдельных белковых фракций. Для этого вычерчивают гра-
фик, на горизонтальной оси которого откладывают номера фракций или
объем прошедшей через колонку жидкости, а на вертикальной оси – вели-
чины оптической плотности фракций. Затем строят график зависимости
между логарифмом молекулярной массы белков-маркеров и объемом
элюирования с колонки. После построения калибровочного графика на ко-
лонку наносят исследуемый белок и, определив объем элюции, находят по
графику его молекулярную массу.
     Хранить сефадекс можно в набухшем состоянии (в холодильнике), доба-
вив к нему 0.02%-й азид натрия. Для перевода сефадекса в первоначальное со-
стояние его перемешивают несколько минут с 2-кратным объемом 50%-го
этанола и фильтруют на воронке Бюхнера. Затем перемешивают 30 мин с
2-кратным объемом неразведенного этанола и опять фильтруют. Обработку
неразведенным спиртом повторяют несколько раз. Осадок высушивают в тер-
мостате при 60–80 °С.

                    ТЕМА 2. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ БЕЛКОВ

    Электрофорез занимает центральное место среди методов исследова-
ния белков и нуклеиновых кислот. В современной научной литературе
редко можно встретить статью, в которой бы на той или иной стадии
фракционирования или характеристики этих биополимеров не был исполь-
зован электрофорез. Метод позволяет разделять макромолекулы, разли-
чающиеся по таким� важнейшим параметрам, как размеры (или молеку-
                                    16

Страницы