Очистка ферментов и методы исследования их каталитических свойств. Климова А.Т. - 15 стр.

     Ve – элюционный объем, равный объему элюата, собранного с момен-
та внесения вещества на колонку до момента его элюции с колонки, вклю-
чая фракцию с максимальным его содержанием.
     Чем выше молекулярная масса белка, тем ниже его элюционный объ-
ем. Поэтому сначала будут выходить белки с большей молекулярной мас-
сой, затем с более низкой и т. д.
     Оборудование и реактивы.
     Натрий-фосфатный буфер, рН 6.5, сефадекс G-200, голубой декстран
(Mr около 2 000 000 Да), белки с определенной молекулярной массой (Да):
яичный альбумин (45 000), бычий сывороточный альбумин (68 000), рибо-
нуклеаза из поджелудочной железы (12 700), цитохром с (13 000).
     Приготовление хроматографической колонки: сухой сефадекс G-200
суспендируют в 100–200-кратном объеме буфера и оставляют набухать в
течение 72 ч при комнатной температуре, или же в течение 5 ч на кипящей
водяной бане (см. прил. 2). В колонку (отношение длины к диаметру
должно равняться 10 : 1, 20 : 1) вносят относительно густую суспензию
полностью набухшего геля. Для предотвращения образования пузырьков
воздуха в слое геля в колонке суспензию сефадекса перед заполнением ко-
лонки можно деаэрировать с помощью водоструйного насоса в колбе Бун-
зена или вносить его в колонку при температуре, значительно превышаю-
щей комнатную (50–60 оС). Для получения хороших результатов разделе-
ния и четких пиков колонка должна быть заполнена равномерно, а верхняя
и нижняя поверхности сефадекса строго горизонтальны. Сефадексу в ко-
лонке дают отстояться, затем с целью уравновешивания и достижения по-
стоянной высоты столба геля колонку промывают 3–5 объемами буферно-
го растовра. Чтобы избежать необратимой деформации частиц геля, мак-
симальное гидростатическое давление при работе с сефадексами не долж-
но превышать допустимого предела – 50, 35, 15 и 10 см водного столба со-
ответственно для сефадексов типа G-75, G-100, G-150, G-200.
      Ход работы. За 2–3 часа перед работой колонку с сефадексом следу-
ет перенести в холодильник. Исследуемую белковую смесь растворяют в
буферном растворе и вносят в колонку. В аналитической работе объем на-
носимого образца должен занимать не более 1–2 % объема колонки.
     Перед использованием колонки определяют ее свободный объем (Vсв.).
Для этого через колонку пропускают 1 мл (1 мг/мл) раствора голубого дек-
страна (линейный водорастворимый полиглюкан с молекулярной массой
                                   15