Очистка ферментов и методы исследования их каталитических свойств. Климова А.Т. - 6 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

ВГУ | Воронеж

Составители: 

Рубрика: 

6
ческие методы отличаются высокой чувствительностью, малыми затрата-
ми времени, реактивов и ферментного препарата).
Оборудование и реактивы.
Раствор крахмала (0,2%), 0,1%-й раствор йода в 0,2%-м растворе йо-
дида калия, раствор слюны – рот ополаскивают 2–3 раза водой, отмеряют
цилиндром 50 мл дистиллированной воды и ополаскивают ею рот в тече-
ние 3–5 мин в несколько приемов, собранную жидкость
фильтруют через
вату и фильтрат используют в качестве источника фермента.
Среда спектрофотометрирования: 50 мМ трис-HCl-буфер, рН 7.5,
1.5 мМ оксалоацетат (М.в. 132 г/л), 0.15 мМ НАДН Na
2 (М.в. 709.4 г/л).
Среда спектрофотометрирования 2: 100мМ трис-HCl буфер, рН 9.0,
4 мМ малат (М.в. 134.1 г/л), 1 мМ НАД
+
(М.в. 663.4 г/л).
Спектрофотометр, набор варипипеток, кюветы, буфер, экстракт фер-
мента, среды спектрофотометрирования, дистиллированная вода и др.
Ход работы.
1. Действие амилазы
: амилаза (КФ 3.2.1.1.) является ферментом, кото-
рый катализирует гидролиз α-глюкозидной связи α-1,4-крахмала и глико-
гена до промежуточных продуктов – декстринов. Крахмал обладает спо-
собностью образовывать с йодом соединение синего цвета, амилодекстрин –
фиолетового, эритродекстрин – красно-бурого, ахродекстрин – желтого.
В две пробирки вносят по 5 мл крахмального клейстера, в одну из них до-
бавляют 0,5 мл раствора слюны, содержащей амилазу, хорошо перемеши-
вают и оставляют стоять. Через 15 мин в обе пробирки прибавляют по
5 капель раствора йода. В пробирке с амилазой слюны раствор через неко-
торое время становится бесцветным, в пробирке без амилазы раствор оста-
ется сине-фиолетовым.
2. Измерение активности малатдегидрогеназы.
Малатдегидрогеназа
(КФ 1.1.1.37.) катализирует превращение малата в оксалоацетат и наоборот
в присутствии НАД
+
или НАДН в качестве кофермента. Для определения
скорости восстановления оксалоацетата МДГ в кювету внести 3 мл среды
спектрофотометрирования 1 и начать реакцию добавлением 0.01 мл рас-
твора МДГ. Для исследования реакций окисления малата использовать
среду спектрофотометрирования 2. Метод измерения активности основан
на учете изменения оптической плотности (уменьшение или увеличение)
при использовании НАДН или НАД
+
при 340 нм. 
ческие методы отличаются высокой чувствительностью, малыми затрата-
ми времени, реактивов и ферментного препарата).
     Оборудование и реактивы.
     Раствор крахмала (0,2%), 0,1%-й раствор йода в 0,2%-м растворе йо-
дида калия, раствор слюны – рот ополаскивают 2–3 раза водой, отмеряют
цилиндром 50 мл дистиллированной воды и ополаскивают ею рот в тече-
ние 3–5 мин в несколько приемов, собранную жидкость фильтруют через
вату и фильтрат используют в качестве источника фермента.
     Среда спектрофотометрирования: 50 мМ трис-HCl-буфер, рН 7.5,
1.5 мМ оксалоацетат (М.в. 132 г/л), 0.15 мМ НАДН Na2 (М.в. 709.4 г/л).
     Среда спектрофотометрирования 2: 100мМ трис-HCl буфер, рН 9.0,
4 мМ малат (М.в. 134.1 г/л), 1 мМ НАД+ (М.в. 663.4 г/л).
     Спектрофотометр, набор варипипеток, кюветы, буфер, экстракт фер-
мента, среды спектрофотометрирования, дистиллированная вода и др.
     Ход работы.
     1. Действие амилазы: амилаза (КФ 3.2.1.1.) является ферментом, кото-
рый катализирует гидролиз α-глюкозидной связи α-1,4-крахмала и глико-
гена до промежуточных продуктов – декстринов. Крахмал обладает спо-
собностью образовывать с йодом соединение синего цвета, амилодекстрин –
фиолетового, эритродекстрин – красно-бурого, ахродекстрин – желтого.
В две пробирки вносят по 5 мл крахмального клейстера, в одну из них до-
бавляют 0,5 мл раствора слюны, содержащей амилазу, хорошо перемеши-
вают и оставляют стоять. Через 15 мин в обе пробирки прибавляют по
5 капель раствора йода. В пробирке с амилазой слюны раствор через неко-
торое время становится бесцветным, в пробирке без амилазы раствор оста-
ется сине-фиолетовым.
     2. Измерение активности малатдегидрогеназы. Малатдегидрогеназа
(КФ 1.1.1.37.) катализирует превращение малата в оксалоацетат и наоборот
в присутствии НАД+ или НАДН в качестве кофермента. Для определения
скорости восстановления оксалоацетата МДГ в кювету внести 3 мл среды
спектрофотометрирования 1 и начать реакцию добавлением 0.01 мл рас-
твора МДГ. Для исследования реакций окисления малата использовать
среду спектрофотометрирования 2. Метод измерения активности основан
на учете изменения оптической плотности (уменьшение или увеличение)
при использовании НАДН или НАД+ при 340 нм.


                                    6

Страницы