Очистка ферментов и методы исследования их каталитических свойств. Климова А.Т. - 8 стр.

     2. Воздействие средней силы, при котором используют лопастной го-
могенизатор или растирание с абразивом (песком, стеклянными шариками).
     3. Сильное воздействие с помощью пресса, ультразвука или шаровой
мельницы. Выбор раствора для экстракции зависит от особенностей иссле-
дуемого белка. Для растворимого белка используют буферные растворы.
Обычно объем раствора в 2–3 раза превышает объем ткани.
     Оборудование и реактивы.
Трис-ЭДТА буфер (ТЕ): 50 мМ трис-НСl, рН 8,0 и 10мМ ЭДТА
(М.в. 292,0); свежеприготовленный раствор лизоцима в ТЕ-буфере, 10 мг/мл.
     Ход работы.
     1. Лизис клеток с применением ферментов. Разрушение клеточных
стенок с применением детергентов и ферментов проводят с небольшими
порциями биомассы. Как правило, время лизиса не превышает 15–30 мин.
Для лизирования клетки E. сoli суспендируют в ТЕ-буфере из расчета 3 мл
буфера на 1 г сырой биомассы и нагревают до 37 оС. Добавляют 1 мл рас-
твора лизоцима на каждые 5 мл суспензии или эквивалентное количество
сухого лизоцима и инкубируют 10–20 мин при 37 оС.
     2. Лизис клеток с помощью детергентов. Это наиболее мягкий и быст-
рый способ разрушения клеток по сравнению с другими методами. Перед
лизисом клетки промывают несколько раз забуференным солевым раство-
ром (например, 10 мМ трис-HCl буфером, рН 7.5, с 150 мМ NaCl). После
последнего центрифугирования биомассу суспендируют до плотности
107–108 кл/мл, или 3–4 мг сухих клеток на 1 мл в том же буфере, с добав-
лением 0,1–0,3 % Тритона Х-100. Содержимое перемешивают и инкуби-
руют на льду от 10 до 90 мин. Для стабилизации белков в экстракт добав-
ляют 0,2 объема 50 % глиицерола. Вместо тритона Х-100 могут быть ис-
пользованы и другие неионные детергенты.
     3. Гомогенизация. Этот способ можно использовать для микроорганизмов
с тонкой клеточной стенкой, для животных и некоторых растительных клеток.
Порции биомассы, суспендированные в буферном растворе (3–5 объемов), пе-
реносят в ручной гомогенизатор и пропускают через него биомассу 10–20 раз.
При использовании механических гомогенизаторов с блендерами время обра-
ботки обычно не превышает 1–2 мин интервалами по 20 с с промежуточным
охлаждением биомассы на льду.
     4. Обработка клеток ультразвуком. Измельчение клеточных суспензий
в ультразвуковом дезинтеграторе широко применяется, особенно для раз-
                                    8