Биотехнология. Коростелева Н.И - 40 стр.

    Практически общий способ трансформации и трансфекции
основан на том, что при обработке клеток бактерий CaCl 2 их
мембрана становится проницаемой для ДНК.
    Одним из самых распространенных методов получения
трансгенных двудольных растений является кокультивация с
агробактерией. Он основан на трансформации растительных
эксплантов агробактериями, несущими векторную конструк-
цию, содержащую чужеродный ген, встроенный в область
т-ДНК.
    Вектор должен иметь функциональный ген (прокатиотиче-
ский или эукариотический), промотор, способный экспрессиро-
ваться в растительной клетке, и селективный маркер трансфор-
мации. В качестве эксплантов берут стерильные листовые дис-
ки, молодые корешки, семядоли, междоузлия. На экспланты на-
носят раны и кокультивируют с жидкой средой, содержащей
агробактерии в течение 24-48 часов. Далее экспланты переносят
на среду с антибиотиками (или гербицидами) для проведения
селективного отбора трансформированых клеток. Кроме того, в
среду добавляют соответствующие фитогормоны (для прямой
регенерации или каллусообразования). Через 2-5 недель на
трансформированном экспланте развиваются побеги, которые в
дальнейшем отсаживают или переносят в почву. Выход транс-
генных растений достаточно высок (10-60% в зависимости от
вида растения).
    Существует несколько методов прямого переноса генов в
растения и клетки животных. Сначала клеточная оболочка раз-
рушается ферментами (целлюлазой, пектиназой), и остается
один протопласт. Наибольшей эффективности трансформации
(10-2) удалось достигнуть методом электропорации и добавле-
нием полиэтиленгликоля. При этом вектор может не содержать
пограничных областей т-ДНК и vir-области, т.е. годится
практически любой ДНК-вектор.
    Это может быть метод микроинъекции ДНК в животные и
растительные (протопласты прикрепляют к стеклам полилизи-
ном) клетки, лучше в их ядра. Трансформация растительных
протопластов происходит с эффективностью не более 10-15%,
независимо от типа вектора, и подходит как для двудольных, так
и для однодольных растений. Более 140 видов растений про-
трансформированы путем прямого переноса ДНК-вектора.

                             40