Методы определения редокс-статуса культивируемых клеток растений. Сибгатуллина Г.В - 10 стр.

     25 мл 0,2 М КН2РО4 и 22,25 мл 0,2 М NaOH смешать и довести до 100 мл
дистиллированной   водой.    Проверить   рН   раствора   (если    значение   не
соответствует необходимому, довести рН с помощью концентрированной
H3PO4 или 5% NaOH.
     Приготовление 50 мМ K,Na-фосфатного буфера, рН 7,0:
     25 мл 0,2 М КН2РО4 и 14,55 мл 0,2 М NaOH смешать и довести до 100 мл
дистиллированной   водой.    Проверить   рН   раствора   (если    значение   не
соответствует необходимому, довести рН с помощью концентрированной
H3PO4 или 5% NaOH).
3) 5 мМ ЭДТА (20 мг ЭДТА растворить в 10 мл дистиллированной воды).
4) 17 мМ аскорбиновая кислота (30 мг аскорбиновой кислоты растворить в 10
мл дистиллированной воды).
5) 0,06% перекись водорода (200 мкл 3% перекиси водорода добавить к 9,8 мл
дистиллированной воды).
6) экстракционный буфер.
     Приготовление экстракционного буфера:
     25 мг поливинилпирролидона растворить в 2,5 мл 50 мМ K,Na-
фосфатного буфера (рН 7,8), добавить 125 мкл 17 мМ раствора аскорбиновой
кислоты и 25 мкл 100 мМ раствора фенилметилсульфонилфторида (ФМСФ) в
качестве ингибитора протеиназ.
                                 Ход работы
     Навеску каллусной ткани массой 150-200 мг растереть в 300-400 мкл
экстракционного буфера в холодной ступке холодным пестиком. Гомогенат
центрифугировать в течение 5 минут при 12 000 g, полученный супернатант
использовать для анализа. Пробы поместить в холодильник (4 °С).
          Реакционная смесь содержит:
          2,93 мл 50 мМ K,Na-фосфатного буфера (рН 7,0)
          30 мкл 17 мМ раствора аскорбиновой кислоты
          30 мкл 5 мМ раствора ЭДТА
          10 мкл клеточного экстракта

                                         10