Методы определения редокс-статуса культивируемых клеток растений. Сибгатуллина Г.В - 27 стр.

            2.2. Выявление изоферментных спектров каталазы
     Для выявления изоформ каталазы в полиакриламидном геле использовали
модифицированный метод Вудбери с соавт. (Woodbury et al., 1983), описанный
Бакаловой с соавт. (Bakalova et al., 2004). Изоформы каталазы наблюдают в
виде неокрашенных участков на фоне интенсивной сине-зеленой окраски геля.
Сине-зеленая окраска геля обеспечивается образованием берлинской лазури
при реакции ферроцианида калия (II) с хлоридом железа (III) в присутствии
перекиси водорода. Отсутствие окрашивания наблюдается в тех участках геля,
где каталаза разрушает перекись водорода.
                            Необходимые реактивы:
     Важно:        все   растворы        для        электрофореза   готовят     на
деионизированной воде mQ.
1) 0,1 М натрий-фосфатный буфер рН 8,0 (3,4 г Na2HPO4×12H2O, 82,5 мг
NaH2PO4 × 2H2O растворить в 100 мл воды. Довести рН, если это необходимо).
2) Tpис-глициновый буфер, рН 8,3 (0,6 г Tрис·HCl (трис(гидроксиметил)-
аминометан), 2,34 г глицина, 0,1 г борной кислоты растворить в 1 л воды).
3) окрашивающие растворы:
А) 100 мг К3[FeCN] растворить в 10 мл натрий-фосфатного буфера (рН 8,0);
Б) 100 мкл перекиси водорода (3%) добавить к 9,9 мл 10 мл Na-фосфатного
буфера (рН 8,0);
В) 100 мг FeCl3 растворить в 10 мл Na-фосфатного буфера (рН 8,0).
                                    Ход работы
     Пробы для электрофореза готовят так же, как описано в методе,
предложенном для определения активности каталазы (см. раздел 1.3).
Обязательно определяют содержание белка в пробе (см. гл. 5.2.). Для
проведения электрофореза пробы выравнивают по содержанию белка (обычно
около 15 мкг).
     Электрофорез        проводят    в    7-8%        полиакриламидном   геле    в
неденатурирующих условиях согласно методике Лэммли (Laemmli, 1970),
исключая додецилсульфат натрия (ДСН) из всех растворов. Разделение

                                               27