Методы определения редокс-статуса культивируемых клеток растений. Сибгатуллина Г.В - 29 стр.

14,5 мл воды).
                                      Ход работы
        Пробы для электрофореза готовят так же, как описано в методе,
предложенном для определения активности растворимой пероксидазы (см.
раздел 1.1). Обязательно определяют содержание белка в пробе. Для
проведения электрофореза пробы выравнивают по содержанию белка (обычно
около 10 мкг).
        Электрофорез      проводят      в    10%    полиакриламидном        геле   в
неденатурирующих условиях согласно методике Лэммли (Laemmli, 1970),
исключая ДСН из всех растворов. Разделение проводят, выставляя напряжение
из расчета 2 В/см2. В качестве электродного буфера используют Трис-
глициновый буфер (рН 8,3) с добавлением борной кислоты в концентрации
0,1%.
        После проведения электрофореза гель помещают в раствор 0,5% уксусной
кислоты.    Через     5-10 минут,     слив    уксусную кислоту,     гель заливают
свежеприготовленным бензидиновым реагентом и оставляют на шейкере на 20
минут.
        Затем бензидиновый реагент удаляют, и гель 1 раз споласкивают 0,5%
раствором уксусной кислоты.
        После этого гель заливают 0,1% раствором перекиси водорода и
наблюдают появление синих полос изоформ пероксидазы.
        При появлении окраски гель фотографируют или сканируют.


        2.4. Выявление изоферментных спектров супероксиддисмутазы
        Выявление изоформ супероксиддисмутазы в полиакриламидном геле
проводят     согласно     методу,    предложенному     Бошаном     и     Фридовичем
(Beauchamp,         Fridovich,      1971)     с    модификациями.         Изоформы
супероксидиддисмутазы выявляются в виде светлых полос на фиолетовом
фоне. Окрашивание геля в фиолетовый цвет обусловлено фотоиндуцированным
свободно-радикальным        окислением       нитросинего   тетразолия.   Отсутствие

                                              29