Методы определения редокс-статуса культивируемых клеток растений. Сибгатуллина Г.В - 31 стр.

инкубируют 20 мин в темноте при комнатной температуре.
     Затем гель переносят в чистую прозрачную емкость и облучают двумя
18В люминесцентными лампами дневного света до появления нужной чёткости
и интенсивности окрашивания. При этом происходит изменение окраски геля
от   светло-жёлтой     до    фиолетовой.        Изоформы   супероксиддисмутазы
проявляются в виде светлых неокрашенных полос. Реакция останавливается
выключением света. Гель быстро фотографируют или сканируют.


      2.5. Выявление изоферментных спектров глутатионредуктазы
     Спектр изоферментов глутатионредуктазы визуализируют согласно
модифицированному методу Рао с соавторами (Rao et al., 1996). Выявление
изоформ происходит в результате реакции глутатиона, восстановленного
глутатионредуктазой,        с      3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2Н-
тетразолием бромидом (МТТ) и 2,6-дихлорофенолиндофенолом (DCIP, или
реактив Тиллманна).
                            Необходимые реактивы:
     Важно:      все   растворы      для        электрофореза   готовят     на
деионизированной воде mQ.
1) 50 мМ K,Na-фосфатный буфер, pH 7,8. Буфер готовят из сток-растворов:
0,2 М КН2РО4 (1,36 г КН2РО4 растворить и довести до 50 мл водой),
0,2 М NaOH (400 мг NaOH растворить и довести до 50 мл водой).
     Приготовление 50 мМ K,Na-фосфатного буфера, рН 7,8:
     25 мл 0,2 М КН2РО4 и 22,25 мл 0,2 М NaOH смешать и довести до 100 мл
дистиллированной водой. Проверить рН раствора и скорректировать с
помощью концентрированной H3PO4 или 5% NaOH.
2) Tpис-глициновый буфер, рН 8,3 (0,6 г Tрис·HCl (трис(гидроксиметил)-
аминометан); 2,34 г глицина, 0,1 г борной кислоты растворить в 1 л воды).
3) Окрашивающий раствор: 20 мг ЭДТА-Na, 4,2 мг окисленного глутатиона, 8,4
мг НАДФН растворить в 20 мл 50 мМ K,Na-фосфатного буфера (рН 7,8) и
добавить предварительно растворенные в минимальном объёме того же буфера

                                           31