Методы определения редокс-статуса культивируемых клеток растений. Сибгатуллина Г.В - 33 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

КФУ | Казань

Составители: 

Рубрика: 

33
3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ НЕФЕРМЕНТАТИВНЫХ
АНТИОКСИДАНТОВ
3.1. Определение содержания глутатиона
Определение общего содержания глутатиона, а также восстановленной
(GSH) и окисленной (GSSG) форм глутатиона, проводят
спектрофотометрически согласно методу, предложенному Зангом и Кирхамом
(Zang, Kirkham, 1996). Содержание общего глутатиона в пробах оценивается в
ходе цветной реакции при образовании комплекса 5,5’-дитиобис-2-
нитробензойной кислотой (ДТНБК) и GSH. Для оценивания содержания GSSG
применяется 2-винилпиридин, который связывается с GSH.
Необходимые реактивы:
1) 5% сульфосалициловая кислота (1 г сульфосалициловой кислоты растворить
в 20 мл деионизированной воды).
2) 0,5 М натрий-фосфатный буфер (рН 7,5) готовят, используя следующие сток-
растворы:
1,55 г NaH
2
PO
4
растворить в 50 мл дистиллированной воды,
0,7 г Na
2
HPO
4
растворить в 10 мл дистиллированной водой.
Для приготовления 100 мл буфера соответствующие количества сток-
растворов (40,5 мл NaH
2
PO
4
и 8 мл Na
2
HPO
4
) смешать и довести до 100 мл
дистиллированной водой. Проверить и при необходимости скорректировать рН
с помощью 5% NaOH или концентрированной H
3
PO
4
).
3) 0,18% раствор Na-ЭДТА (36,8 мг Na-ЭДТА растворить в 20 мл 0,5М натрий-
фосфатного буфера).
4) 0,12% раствор 5,5-дитиобис(2-нитробензойной кислоты) (12 мг 5,5-
дитиобис(2-нитробензойной кислоты) растворить в 10 мл этанола).
5) 0,16% раствор НАДФН (1,6 мг НАДФН растворить в 1 мл деионизированной
воды).
Ход работы
Навеску каллусной ткани (250 мг) растереть в 1 мл 5% раствора
сульфосалициловой кислоты и центрифугировать 5 мин при 10 000 g. 
         3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ НЕФЕРМЕНТАТИВНЫХ
                              АНТИОКСИДАНТОВ
                    3.1. Определение содержания глутатиона
       Определение общего содержания глутатиона, а также восстановленной
(GSH)       и      окисленной         (GSSG)        форм      глутатиона,     проводят
спектрофотометрически согласно методу, предложенному Зангом и Кирхамом
(Zang, Kirkham, 1996). Содержание общего глутатиона в пробах оценивается в
ходе     цветной    реакции     при    образовании         комплекса   5,5’-дитиобис-2-
нитробензойной кислотой (ДТНБК) и GSH. Для оценивания содержания GSSG
применяется 2-винилпиридин, который связывается с GSH.
                              Необходимые реактивы:
1) 5% сульфосалициловая кислота (1 г сульфосалициловой кислоты растворить
в 20 мл деионизированной воды).
2) 0,5 М натрий-фосфатный буфер (рН 7,5) готовят, используя следующие сток-
растворы:
1,55 г NaH2PO4 растворить в 50 мл дистиллированной воды,
0,7 г Na2HPO4 растворить в 10 мл дистиллированной водой.
       Для приготовления 100 мл буфера соответствующие количества сток-
растворов (40,5 мл NaH2PO4 и 8 мл Na2HPO4) смешать и довести до 100 мл
дистиллированной водой. Проверить и при необходимости скорректировать рН
с помощью 5% NaOH или концентрированной H3PO4).
3) 0,18% раствор Na-ЭДТА (36,8 мг Na-ЭДТА растворить в 20 мл 0,5М натрий-
фосфатного буфера).
4) 0,12% раствор 5,5-дитиобис(2-нитробензойной кислоты) (12 мг 5,5-
дитиобис(2-нитробензойной кислоты) растворить в 10 мл этанола).
5) 0,16% раствор НАДФН (1,6 мг НАДФН растворить в 1 мл деионизированной
воды).
                                      Ход работы
       Навеску каллусной ткани (250 мг) растереть в 1 мл 5% раствора
сульфосалициловой кислоты и центрифугировать 5 мин при 10 000 g.

                                               33

Страницы